Pierce Peptide Quantitative Assay

Protein digestion/clean-up 과정에서 얼마만큼의 시료의 없어질까? 실제 질량분석기에 주입되는 양은 얼마나 될까?  

 

질량분석기를 위한  단백질 시료 전처리과정에서 많은 시료의 손실이 있습니다. 하지만 질량분석기에 주입할때는 시료의 손실이 없다고 가정하고 처음에 측정한 단백질의 농도를 고려해서 주입하는 경우가 있습니다. 물론 항상 동일한방법으로 주입하면 상관이 없습니다.

 

Trypsin digestion후 C18 clean-up 과정에서 피할 수 없는 손실이 있습니다.  단백질마다 아미노산의 배열이 다릅니다. 또한 K와 R이 적절히 배치되어 있지도 않습니다. 그러므로 Trypsin digestion시 절단되는 펩타이드가 아주 작은 사이즈일 경우 C18에 결합하지 않고 빠져나옵니다. Trypsin digestion질량분석기로 측정해도 검출이 안될 가능성이 있습니다.

 

 

컬럼에 주입될 때 시료의 양이 대략 어느정도 되는지, 또한 정량분석시 주입된 양을 확인하기 위해서  Pierce Peptide assay kit를 구매해서 테스트를 해보았습니다.

 

Pierce™ Quantitative Peptide Assays & Standards (thermofisher.com)

 

 

 

100 µg Mouse Liver tissue를 SDS buffer 추출한 시료와 Pierce 사의 2 µg HeLa Digest standard 를 각각 측정해보았습니다.

 Mouse Liver tissue의 경우 전체양을 환산했을 때 68 µg이 나왔고 HeLa Digest std의 경우 1.89 µg이 나왔습니다. Mouse Liver tissue의 경우 30%의 손실이 있습니다. Clean-up과정에서 손실이 되었을 듯합니다.  S-trap과 C-18 clean-up과정을 통해 50% 가량이 손실될 것이라고 생각했는데 생각보다 많지는 않습니다.  HeLa Digest std경우 실제 양과 거의 비슷하게 나왔습니다. 회사에서 정량된 값으로 판매되기 때문에 부정확할 이유는 없을 듯합니다.