Histone PTM 분석을 위한 최적화 과정 2

DIA를 이용한 Histone PTM 분석 절차중에서 LC-MS/MS 부분은 상대적으로 어렵지 않습니다. 오히려 선택적인 Histone 추출,  4 번의 Propionylation  그리고 분석후 데이타베이스 검색과정이 매우 까다롭습니다.  Histone을 높은 순도로 추출하게 되면 시료안의 단백질의 숫자는 상대적으로 매우 적기 때문에  특별한 DIA 방법이 필요가 없습니다.  기존의 논문에서 OTIT 방법으로도 분석을 하였습니다.

 

Orbitrap Eclipse와 Vanquish Neo 시스템에서 60min LC gradient를 이용하여 몇가지 isolation window 값으로 테스트를 해보았습니다. 실제 DIA 분석은 EpiProfile을 사용할 예정이지만 간단히 Peak Intensity와 Data point를 확인하기 위해서 DIA 분석후 Skyline을 사용하였습니다.

 

대표적인 펩타이드에 해당하는 Product ion의 XIC입니다.  약간의 RT  shift가 있습니다. Isolation window size에 따라 Data point가 약간씩 차이가 납니다. 당연한 결과이지만 Isolation window size가 커질수록 Data point는 증가하는것을 볼수 있습니다. 

(Dimethyl, Propionyl) STGGK(Propionyl)APR m/z 521.3062 (2+), y8 829.4934

 

Human Histone PTM 분석용으로 만든 Skyline으로 Calf Thymus 시료를 분석하였습니다. 몇개의 펩타이드가 동일하기 때문에 간단히 테스트하는데는 문제가 없습니다. 

 

대표적인 PTM peptide 에 대한 정량값입니다. Isolation window에 따라  정량값에는 큰 차이를 보이지 않습니다. 정량값에 큰 차이가 없는 선에서 Data point가 6~8정도되는 값을 정하면 될듯합니다. 물론 Intensity가 더 낮은 펩타이드로 체크를 하면 결과는 달라질수 있습니다. 아무튼 30~40 m/z의 isolation window를 선택하면 괜찮을듯합니다.