Histone PTM 분석을 위한 최적화 과정 1

Histone PTM 분석 플래폼

 

• 연구소의 Epigenetics department 에 속한 실험실의 요청으로 Histone PTM 분석법을 새롭게 정립하고 있습니다. 특별히 새롭게 분석법을 개발하는것이 아니라 기존의 방법을 토대로   분석플랫폼을 만들고 있습니다.

 

 

Histone  분석에 관한 글은 아래에 있습니다.

 

Histone Propinolylation을 통한 bottom-up proteomic analysis (tistory.com)

Histone Propinolylation을 통한 bottom-up proteomic analysis

Histone 의 Isobaric PTM Peptides 분석하기 (tistory.com)

Histone 의 Isobaric PTM Peptides 분석하기

Orbitrap Eclipse로 Histone H3의 Middle-down 펩타이드 분석하기 (tistory.com)

Orbitrap Eclipse로 Histone H3의 Middle-down 펩타이드 분석하기

 

 

 

시료전처리를 위한 Standard Histone Samples

 

• 시료 전처리 특히 Propionylation 과정이 제대로 되는지, 다양한 isobaric PTM 펩타이드가 검출되는지 확인하기 위해서 적당한 standard 시료가 있으면 좋습니다.  HeLa standard와 같이 상용화된 Histone PTM 시료가 있으며 좋겠지만 그렇지 못합니다.  Human이나 mouse 경우 사용화된것이 있기는 하지만 매우 비쌉니다. 그래서 마음편하게 여러가지 분석을 할수가 없습니다.
• 저렴하게 구매할수 있는것이 Signma Aldrich에서 판매하는 Calf Thymus histone입니다. 25mg에 70불 정도 하니깐 아주 저렴합니다. 보통한번 분석에 50ug정도 사용하니깐 충분한 양입니다.

 

 

 

Propionylation

 

• Histone 분석에서 중요한 시료전처리 과정입니다.   프로토콜대로 진행하여 분석한후 Propionylation이 제대로 되는지 확인이 필요합니다. OTOT DDA로 분석한후 데이타베이스 검색을 합니다 이론적으로는 PTM이 없는 K과 N-terminal에 모두 Propionylation이 되어야 합니다.

 

• 아래는 Calf Thymus histone을 100ng을 분석한 크로마토그램입니다.  Propionylation을 하지 않을 경우 대부분의 펩타이드는 아주 작은 조각으로 되어서 이런 크로마토그램이 나오지 않습니다

• 아래는 Proteome Discoverer의 검색 파라미터입니다.

 

• 아래는 검색후 얻어진 결과입니다. Histone이 가장 많이 검출이 되었고 다른 단백질도 검출이 되었습니다. 

• 펩타이드 결과를 보게 되면 대부분의 펩타이드가 Propionylation이 되어 있습니다.  시료전처리가 아주 잘된것을 확인하였습니다