Dia7 Exploris 480 설치후 테스트 (2)-noFAIMS DIA 아무래도 가장 관심있는 분석법이 DIA입니다. Orbitrap Eclipse에서는 FAIMS를 장착하면 검출수가 상당히 증가되었습니다. Exploris 480에서는 어떤 경향을 보이는지 확인이 필요합니다. 먼저 FAIMS가 없는 상태에서 몇가지 실험을 하였습니다. 100ng HeLa standard를 이용하여 다양한 isolation window에서 분석을 하였습니다. 검출수와 더불어 data point 수를 확인하기 위함입니다. 아래는 60min와 120min LC gradient에서 각각 얻어진 결과입니다. 60min LC gradient에서 단백질/펩타이드 수 및 data point수 비교 120 min LC gradient에서 단백질/펩타이드 수 및 data point수 비교 Isolation w.. 2023. 5. 29. Sutter instrument P-2000/F laser puller protocol Nano capillary column을 만드는데 있어서 이전에 사용하던 프로그램이 새 장비에 적절치 않다는것을 알게 되었습니다. 아마 laser의 강도가 다르기 때문일듯합니다. 이것저것 해보다가 혹시나 하고 업체에 연락을 하니 Protocol을 보내주었네요. 먼저 이 방법대로 시작해서 추가적으로 최적화 하면 될듯합니다. 2022. 5. 27. DIA experiments with noFAIMS vs FAIMS? 이전글에 FAIMS를 이용한 DIA 분석에 대해서 간단히 설명하였습니다. 언급했듯이 FAIMS를 이용한 DIA에서는 각 CV값별로 분석시간이 요구됨으로 Cycle time 관점에서 보면 단점이 있습니다. 하지만 반대로 complexity를 줄여서 감도를 향상시키는 장점이 있습니다. 둘 중에 효과가 큰것에 따라 장점이 될수 있고 단점이 될수 있을 듯합니다. 앞으로의 DIA분석에서 FAIMS를 사용해도 될지 결정하기 위해서 간단히 비교실험을 해보았습니다. Promega사의 K562 를 tryptic digestion후 2ug을 각각 3번 주입하였습니다. No FAIMS와 FAIMS에서의 질량분석기 파라미터는 기존의 실험에서 최적화한것을 각각 사용하였습니다. 모두 8 data-points 이상을 가지는 조건으.. 2022. 5. 27. FAIMS를 이용한 DIA분석에서 고려해야 될것들 DIA의 목적은 분획하지 않고 최대한 많은 단백질/펩타이드를 검출하는것과 더불와 높은 정량성을 얻기 위함입니다. 그러므로 FAIMS를 이용한 DIA분석조건을 최적화하기 위해서는 단백질/펩타이드의 수의 증가와 함께 정량성을 반드시 고려해야 됩니다. FAIMS의 경우 CV값별로 DIA를 수행해야 함으로 FAIMS가 없는 상태에서 하는것보다는 한 Cycle을 완료하는데 더 시간이 많이 소요됩니다. Data Point 정량성을 고려할때 체크해야할 것중에 하나가 Data point입니다. 보통 8~10 point가 되면 좋습니다. Isolation window값이 적어질수록 그리고 CV값의 수가 증가될수록 검출되는data point는 줄어들게 됩니다. Qualbrowser 에서 DIA data point 수 확인.. 2022. 5. 25. Orbitrap Eclipse에서 DIA Isolation window값 정하기 "Orbitrap Eclipse에서 DIA 분석조건의 최적화를 위해 먼저 적절한 Isolation window값을 찾고자합니다." Orbitrap Eclipse 설치후 DDA 실험방법 테스트는 거의 끝낸것 같습니다. 이번에는 적절한 DIA Method를 만들려고 합니다. 사실 모든 실험방법마다 최적화를 하면 좋겠지만 어느정도의 만족할만한 단백질/펩타이드수만 검출될수 있다면 무난히 사용해도 될듯합니다. DIA만을 전문적으로 하는 실험실이라면 보다 더 세밀하게 최적화를 해야겠지요. Orbitrap Eclipse의 빠른 속도와 감도로 인해서 이전 장비에 비해서 isolation window를 조금더 줄여도 될듯합니다. 하지만 검출수와 더불어 중요한것은 각 피크당 Data point의 수입니다. 보통 8~10개.. 2022. 3. 19. EnclycopeDIA와 Spectronaut 를 이용한 Human Plasma DIA 분석법 비교 Plasma 시료를 Overlap 방식을 이용한 EnclycopeDIA 프로그램방식과 non-overlap 방식으로 Spectronaunt 프로그램 방식을 분석해보았습니다. High abundant proteinds을 제거하지 않으면 검출되는 단백질의 수는 아주 제한적입니다. Plasma 시료에 대한 관련글은 아래와 같습니다. 관련글 혈액단백질 (Plasma & Serum)의 프로테오믹스 분석의 어려운점 혈액단백질 (Plasma & Serum)의 프로테오믹스 분석의 어려운점 대학원 그리고 박사후 연구원동안 혈액에서의 바이오마커를 검출하는 일을 하였습니다. 혈액은 가장 쉽게 확보할수 있는 생체시료이기에 진단용으로 아주 유용합니다. "한방울의 혈액"으로 많 proteomicstechnology.tistory.. 2021. 4. 26. 이전 1 2 다음
