C18 컬럼에서 펩타이드가 분리되는 과정

펩타이드는 어떻게 C18 컬럼을 통과하면서 분리가 되는걸까요? 요즘은 모든 장비가 자동화가 되어 있어서 크로마토그래피 이론을 잘 알지 못해도 실험하는데 큰 문제가 없습니다. 펩타이드의 분리조건은 보편적으로 사용하는 방법을 사용하면 됩니다.  하지만 크로마토그래피의 원리를 잘 알게되면 장비에 문제가 있거나 일반적이지 않은 시료를 분리할때 도움이 되곤합니다.

 

펩타이드가  컬럼에 들어가면 이동상인 H2O+Acetonitrile 와 컬럼의 정지상인 C18에 맞닥뜨리게 됩니다. 이때 펩타이드는 자신이 좋아하는 성질에 더 오래 머물게 됩니다.  hydrophobic 한 펩타이드는 대부분 hydrophobic한 C18에 결합되게 됩니다. 유유상종의 개념입니다.

 

 

 하지만 뒤에서 펌프의 강력한 힘으로 이동상을 보내면서 둘 사이를 떼어놓으려고 합니다. 그럼에도 불구하고 둘 사이는 매우 끈끈한 정이 있어서 잘 떨어지지 않습니다. 이동상의 조건이  처음에는 Hydrophilic한 H2O가 대부분이기 때문입니다.  대부분의 펩타이드는 hydrophbic한 성질임으로 hydrophilic한 H2O는 거들떠 보지도 않습니다.  이때  LC gradient가 진행되면  hydrophobic한 성질을 가지는 Buffer B(Acetonitrile)의 함량이 점점 많아지게 됩니다. 그렇게 되면 펩타이드는 조금씩 갈등을 합니다. hydrophoicity가 낮은 펩타이드는 자신의 성질과 더 유사한 이동상조건의 이동상으로 옮겨갑니다.   즉 hydrophobiclity가 큰 펩타이드는 C18에 더 오래 머물게 되고 반대로 hydrophilic한 펩타이드는 덜 오래 머물게 됩니다.  그렇다고 한곳에만 머무르는것이 아닙니다.  C18과 이동상을 왔다갔다하게 됩니다. 뒤에서 펌프가 강력한 힘으로 밀고 있기 때문에 컬럼 밖으로 나갈려는 힘과 정지상에 머물려는 힘이 동시에 작용합니다. C18에서 떨어진 펩타이드는 바로 이동상으로 가게 되고 펌프의 압력으로 앞으로 전진합니다. 하지만 여전히 앞에는 C18정지상이 기다리고 있습니다. 다시 붙잡게 됩니다. 이러한 과정이 수 없이 반복되면서 펩타이드는 분리가 됩니다. 

 

 

우리가 retention time이라고 부르는 이유도 펩타이드가 정지상에 머물고 있는 시간을 의미합니다. 분리가 잘된다는것은 이렇게 이동상과 정지상을 왔다갔다하는 반복수가 많게 되어  아주 유사한 성질을 가지는 펩타이드까지도 분리를 할수 있다는 의미입니다.

 

C18의 사이즈가 5 µm, 3 µm, 2 µm 등으로 줄어 들수로 분리가 잘되는 이유는 같은 공간에 더 작은 입자가 충진될수록  펩타이드와의 결합하는 표면적이 더 넓어지기 때문입니다.  컬럼의 길이가 길어도 분리능이 증가됩니다. 달리기의 속도가 유사한 사람이 10 m 달리기에서는 큰 차이를 보이지 않지만 100 m 경주에서는 확연히 차이가 나게 됩니다. 

 

그렇다면 왜 프로테오믹스에서는 이동상에서 Acetonitrile을 사용할까요? Acetonitrile은 유기용매중에서 중간정도의 hydrophobilcity를 가지고 있습니다. 즉 물과 잘 혼합되면서도 hydrophobic한 성질을 가지고 있기 때문입니다. 유사한 용매로 methanol이 있습니다. 오래전에 연구자들은  Acetonirile이 Methanol보다 분리에 더 좋다는것을 확인도 하였습니다.