Thermo Orbitrap Exploris 480 Benchmark (Data-Dependent Acquisition)

2021년 초에 설치되었던 Exploris 480이 다른 큰 프로젝트를 수행하다가 드뎌 제 손으로 직접 테스트 해보게 되었습니다.  비록 완전 새것 상태에서는 바로 테스트를 못한것이 아쉬움이 있지만 그래도 거의 한달간 직접 테스트를 해볼수 있게 되었습니다.  FAIMS Pro로 장착하여 테스트도 해보았습니다.  몇개로 나누어서 글을 올릴 예정입니다.

 

Exploris는 모양과 크기면에서 Q-Exactive 시리즈와 유사한 Orbitrap Fusion과 친척입니다.   그래서 Orbitrap Fusion에서 사용하던 FAIMS나 EasySpray Source를 호환하여 사용할수 있습니다.  이전글에 QE-HF Benchmark에 관한 내용을 적었듯이 Exploris 480 장비도 차후 Maintenance 를 위해 Benchmark 실험을 하였습니다.

 

 

Orbitrap Exploris 480 coupled with a Dionex UPLC

 

저는 모든 장비에 대해 일단 200 ng HeLa standard / 60min LC gradient 를 이용하여 DDA 결과를 얻습니다. 단백질과 펩타이드의 수를 통해 대략의 감도를 예측합니다. 서로 다른 장비와의 비교도 용이합니다. 

 

최근에 software가 업그레이드 되면서 AGC나 maximum injection time에 대해 여러개의 옵션이 있습니다. 일단 기본적으로 Standard 나 Auto를 선택하고 분석합니다. 

 

200ng HeLa standad with 60min LC gradient (Data Dependent Mode)

 

 

아래는 대표적인 200 ng HeLa 에서 얻어진 대표적인 Base-peak chromatogram (60 min) 입니다. 

 

Base-Peak Chromatogram of 200 ng HeLa (60min LC gradient)

 

 

먼저  Data Dependent Mode 에서 cycle time과  몇가지  서로 다른 scan  number를 사용하여 비교해보았습니다.

 

특별히 검출된 단백질과 펩타이드의 수에서 차이가 없습니다. 약 3000개 내외의 단백질이 검출되었습니다. 

 

200 ng HeLa standard, 60min LC gradients

200ng HeLa standad with 30min LC gradient

동일한 200 ng HeLa standard를 짧은 LC gradient인 30 min에서 분석해보았습니다. Gradient가 짧아진 만큼 TOP40 과 낮은 resolution/maximum injection time(MS2)와 비교해보았습니다. 특별히 최적화가 필요없이 AGC와 Maximum injection time를 기본값인 standard 와 Auto로 사용해도 될것같습니다. 

 

200 ng HeLa standard, 30min LG Gradient

 

Dynamic Exclusion Properties (Singe Charge state per Precursor only)

Dynamic Exclusion Properties 에서 Precursor ion에서 한가지 Charge state에 해당하는 펩타이드만 검출되게 하는 옵션이 있습니다. 동일한 펩타이드이지만 서로 다른 Charge state를 중복해서  검출하는것을 막기 위함입니다. 얼마나 도움이 되는지 확인해보았습니다.

 

 

아래에서 보듯이 특별히 차이는 없는것 같습니다. 보통 2+ 나 3+ 펩타이드가 동시에 나오지만 특정 한개아 나머지 한개 보다 더 높은 감도를 보입니다. 그래서 DDA에서  두 쌍의 펩타이드가 모두 검출되기 보다는 한개만 검출된후 다른 종류의 펩타이드가 검출되는 경우가 많습니다. 이러한 이유로 두 방법에서 큰 차이가 없는것 같기도 합니다.  만약 Plasma와 같이 Dynamic range가 넓은 시료의 경우에는 도움이 될수도 있을것같습니다.  

 

1 ng and 10 ng HeLa standard with 120min LC gradinet 

이번에는 1 ng과 10 ng HeLa standard를 이용하여 몇가지 조건에서 120 min LC gradient로 분석한 결과입니다. 시료의 양이 적을 때는 MS2 resolution과 AGC값을 약간 올리는것이 도움이 되는것 같습니다.

 

1ng and 10ng HeLa standard with 120min LC gradient

 

0.05 µL Human Plasma with 60 min and 120 min LC gradient 

이번에는 1 ng과 10 ng HeLa standard를 이용하여 몇가지 조건에서 120 min LC gradient로 분석한 결과입니다. 시료의 양이 적을 때는 MS2 resolution과 AGC값을 약간 올리는것이 도움이 되는것 같습니다.

 

 

검출된 단백질과 펩타이드수는 아래와 같습니다.   Q-Exactive 시리즈나 Orbitrap Fusion 에서 검출되는 숫자와 비교하면 큰 차이는 없는것 같습니다. 

 

 

 

 

 

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