DIA와 DDA에서 Replicate 수의 증가에 따른 검출 단백질수의 변화

DIA 데이타를 Spectronaut로 분석할때 시료의  수가 증가되면 개별적인 시료의 검출단백질수가 증가되는지 확인해보았습니다.

 

DDA분석를 이용한 Label-free Quantitation (LFQ)분석시 MaxQaunt에서는 Match-to-run 이나 Proteome Discoverer Feature map/Minora Feature Detector 기능이 있습니다.  이 기능은 특정 시료에서  MS/MS가 수행되지 않더라도 다른 시료에서 유사한 Retention timer과 동일한 Precursor ion에 대한 MS/MS 결과 있다면  검출된것으로 고려됩니다. 즉  이기능을 이용하면  분석하는 시료의 수가  증가될때 개별적으로 검출되는 단백질의 수도 조금씩 증가되는 경향이 있습니다.   DDA 분석에서 missing value로 인한 정량분석의 문제점을 어느정도 해결해 주는 역활도 합니다. 

 

DIA 분석에서도 이러한 경향이 있는지 간단히 확인해보았습니다. 

Data-Independant-Acquisition

이를 위해서  200ng HeLa digest를 동일한 DIA 조건에서 5번 분석하였습니다.  아래는 크로마토그램입니다. 얻어진 raw file은 Spectronaut로 분석하였습니다. 

 

아래 붉은 색은 각각의 시료수에서 얻어진 전체 단백질 숫자 입니다. 붉은색은 각각의 분석에서 첫번째 Replication에 해당하는 단백질의 숫자입니다. 전체 숫자에서  정량값이 없는 missing value는 제외하고 순수하게 검출된 단백질 숫자만 고려하였습니다.  그래프에서 보듯이 전체 단백질 숫자와 개별 단백질숫자의 변화가 크지 않습니다. 아마 DIA의 경우 missing value가 상대적으로 적기때문일것이라 생각합니다.

 

 

 

 

 

Data-Dependant-Acquisition

비교를 위해서 동일한 시스템에서 DDA로 분석하여 Proteome Discoverer 2.4로 정량분석후 얻어진 그래프는 아래와 같습니다. 검출이 되었어도 정량값이 없는 단백질은 제외하였습니다. DDA의 경우 시료의 수가 증가될수록 검출된 전체 단백질수와 함께 개별 단백질의 수도 약간씩 증가되는 경향을 보입니다. DIA와는 다르게 missing value가 더 많이 존재하기 때문에서 반복실험을 통해 추가로 검출되는 수가 증가되는것 같습니다. 

 

만약 Biological replicate의 수가 그다지 많지 않다면 동일한 시료를 여러번 반복분석(Technical replicates)한 결과를 포함시킨다면 얻어지는 전체 단백질수는 증가될수 있습니다. 정량분석결과에는 큰 변화는 없겠지만 검출숫자는 많아지는 효과가 있습니다

 

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