Thermo Q-Exactive HF benchmark Experiments

오래전에 Refurbished QE-HF를 설치한후 Benchmark 실험을 한 데이타를 정리하여 보았습니다. 비록 완전 새것은 아니지만 특별히 장비에 문제가 없는 상태에서 구입을 하였습니다.   장비가 설치되면  Reference 를 위해서 데이타를 수집해놓습니다. 차후 문제가 생겼을때 Reference  데이타를 참고로 장비 상태를 확인할수 있습니다. 또한 업체에 문제여부를 크레임할때로 유용합니다.

 

Standard BSA

Standard BSA를 이용하여 30min gradient 로 DDA를 수행합니다. Sequence coverage와 검출된 펩타이드 수를 확인합니다. 검색 프로그램에 따라 데이타가 달라짐으로 가능한 동일한 프로그램에서 동일한 검색조건을 사용합니다. 

아래는 20 fmol BSA에 대한 크로마토그램입니다.

 

 

아래는 100 fmol BSA에 대한 크로마토그램입니다

 

20fmol 과 100fmol에 대한 sequence coverage와 검출 펩타이드수를 보여줍니다.

 

 

HeLa Standard Digest

가장 많이 사용하는 Standard 는 Pierce의 HeLa digest입니다. 보통 200ng을 주입합니다. Orbitrap Fusion 장비에서 OT-IT 모드로 60min LC gradient 조건일 경우 장비상태가 좋을 경우 3000~3200개의 단백질이 검출됩니다. 하지만 보통 장비상태에서는 2700~2900 개 정도가 검출됩니다. 그래서 보통 2500개 이하의 단백질이 검출되면 장비감도가 떨어지고 있음을 예측할수 있습니다.

 

 

HF의 경우 몇가지 조건(MS2 resolution, Top10 vs Top20)에서 대략 2500~2600개 정도가 검출되었습니다.  여러가지 요인에 따라 단백질수의 갯수는 차이가 날수 있습니다.  더 최적화를 하면 더 많은 단백질이 검출될수 있습니다. 하지만 Reference 데이타로 사용할 예정임으로 동일한 조건에서 검출하여 상대적인 단백질 수만 비교하면 됩니다.

 

Chromatogram of 200ng HeLa standard (60min gradient)

 

 

HeLa In-solution digest

아래는 실제 실험실에서 얻은 HeLa cell lysate를  in-solution digestion한 시료를 분석한 결과입니다.  2 µg 시료에서 몇가지 조건에서 60min 와 120 min에서 검출한 단백질과 펩타이드 수입니다. 60 min gradient에서 대략 3000개의 단백질이 검출되고 120 min에서는 대략 3800개의 단백질이 검출됩니다.

 

 

아래는 30min Gradient와 60 min gradient에서의 검출된 단백질 숫자를 보여줍니다.

아래는 30 min LC gradient로 TOP 40 DDA를 수행하였을때 Full scan이후 Top 1 과 Top 40 에 대한 MS/MS 스펙트럼을 보여줍니다.  Top 40 피크에서도 좋은 스펙트럼을 보여줍니다.

 

 

 

 

Unscheduled PRM

아래 그림은 Unscheduled PRM에서  Target 펩타이드의 숫자를 20개와 40로 각각 분석했을때 검출된 두 펩타이드의 정량값을 보여주입니다. Target의 숫자가 2배가 증가하더라도 감도에서는 크게 감소가 없음을 알수 있습니다.

 

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