Stage-tip hpRP fractionation with the limited amount of phosphopeptides

Phosphopeptides 분석에 있어서 다양한 전략이 있습니다.  보통 처음 시료의 양에 따라 실험자가 선호하는 방법이 있습니다. 만약 시료의 양이 많을 경우 Digestion후 펩타이드를 분획하여 각 분획을 TiO2등으로 enrichment 합니다. 이렇게 할 경우  최대한 많은 phosphopeptide를 검출 할 수 있습니다.

 

하지만 시료의 양이 제한되어 있다면 분획후 TiO2를 수행하는 과정에서 시료의 손실이 있게 됩니다.    전체 펩타이드에서 Phosphopeptide가 차지하는 비율이 적기 때문에 최종 회수되는 양은  많지 않을것이라 예상할 수 있습니다. 그래서  TiO2후 얻어진 phosphopeptide를 바로 질량분석기로 분석할수 있습니다. 또한  TiO2 분획후  micro-scale로 다시 분획하여 분석할수도 있습니다.  개인적으로는 적은양의 C18로 충진된 stage-tip을 이용하여 high-pH reversed-phase fractionation을 선호합니다.  Micro-scale로 분획하는 것임으로 TiO2 수행후 얻어진 소량의 phosphopeptide의 손실을 최소화 할 수 있습니다.

 

 2개의 500ug mouse liver 시료를 각각 TiO2로 Enrichment 한 후 분획없이 질량분석에 주입한것과 stage-tip으로 4개의 분획후 얻은 결과를 얻어보았습니다.

 

 

 

분획없이 분석한 시료의 경우 최종 20 ul에서 15ul 와 5ul로 나누어서 두번 분석하였습니다. 주입양에 따라 차이를 보고 싶었습니다.  아래는 각각의 크로마토그램입니다. 당연히 크로마토그램의 모양은 동일합니다. 단지 Intensity가 약간 다릅니다.

 

각 각에서 얻어진 Phosphopetide 수에 대한 비교 그래프입니다.

 

 

아래는 stage-tip으로 4개로 분획후 분석한 크로마토그램입니다.

 

 

분획하지 않은 결과와 비교하면 약간 더 많이 검출이 되었습니다.  분획하지 않은 시료를 120 min으로 두번 분석하였고 4개로 분획한 시료는 60 min으로 분석하였기 때문에 장비분석시간은 거의 유사합니다. 

 

Conclusion

Stage-tip을 분획은 아주 간단합니다. 5분 이내에 가능함으로 특별히 추가적이  노력이 필요하지 않습니다. 이렇게 적은 노력으로 Phosphopeptide 수를 조금이라도 증가시킬수 있습니다.

 

 

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