Phosphopeptide 분석을 위한 TiO2 와 Zr-IMAC beads 비교

Phosphopeptide 분석은 항상 오르지 못할 나무 같습니다. 논문에서 만개 이상의 검출되는 phosphopeptide 수를 볼때마다 뭔가 특별한 노하우가 있어보입니다. 하지만 논문의 제시하는 방법은 여느 방법과 별다른것이 없어 보입니다. 분석서비스를 위해서는 phosphopeptide 분석을 위한 방법을 조금 더 업그레이드 해야할 필요성을 느낍니다. 분석서비스중에 phosphopeptide의 정량분석에 대한 요청이 많은 편입니다. 보통 TMT 분석방법과 결합하여 정량분석합니다. 각각의 시료 하나씩 TiO2등으로 enrichment하게 되면 회수되는 펩타이들의 재현성이 떨어지게 되어 최종 정량분석결과에 좋지 않은 영향을 줍니다.

Enrichment 방법 중에서 가장 많이 사용하는 것이 TiO2이며 상당히 많은 논문에서 GL science의 TiO2 beads를 사용합니다(바로가기). 그리고 최근에 South Africa에 본사를 둔 Resyn Bioscience 사의 magetic beads 형태로 된 다양한 chemistry (Ti-IMAC, Zr-IMAC etc) 가 논문에 많이 등장하는걸 보았습니다. 현재 Resyn Bioscience사의 CEO 와 프로테오믹스 책임자와 연락을 주고 받으면서 제품에 대해 성능 평가를 하고 있습니다. 최근에 Opentrons 사의 OT-2 Automation liquid handler를 구매하였습니다(바로가기). 아마 이 장비에 magetic beads 형태를 적용하면 보다 더 효율적으로 전처리를 할수 있을것이라 기대합니다.

최근에 GL-Science사의 TiO2 beads와 Resyn Bioscience사의 Zr-IMAC 를 이용하여 10-Plex TMT 시료에 적용해보았습니다. 각각의 beads에 대한 protocol은 아래와 같습니다.

TiO2

Zr-IMAC

그림과 같이 10-Plex TMT가 결합된 human cell 1mg을 절반으로 나누어서 각각의 beads에 적용한후 최종 회수된 시료의 절반을 classic QE로 분석하였습니다. 그리고 동일한 방법으로 처음부터 반복수행하였습니다.

각각의 분석에서 얻어진 크로마토그램은 아래와 같습니다.

각각의 beads에서 검출된 Phosphopeptides의 수에 대한 벤다이어그램입니다. TiO2 beads에서 약간 더 많이 검출되었지만 전반적으로 크게 차이가 나지 않습니다. 하지만 검출된 상당히 많은 수의 phosphopeptides가 각각의 방법에서 검출되었습니다. Chemistry가 다르기 때문에 회수되는 펩타이드의 종류도 차이가 나는것 같습니다. 즉 한종류의 beads 보다는 서로다른 형태의 beads를 동시에 사용하며 검출되는 펩타이드의 수를 증가시킬수 있습니다.

각각의 방법에서만 검출된 phosphopeptide 중에서 single, double, triple phosphorylation 여부를 비교해보았습니다.

본 결과를 보면 single에 비해서 상대적으로 multiple phosphorylated peptides의 비율이 TiO2 beads에서 약간 높습니다. 기존의 논문을 보면 IMAC이 TiO2보다 multiple phosphopetpide에 대해 더 선택성이 있다고 소개합니다. 하지만 여기서는 반대의 결과가 나왔습니다.

앞으로는 두개의 다른 종류의 magnetic beads를 OT-2 Automatic Liquid Handler에 적용하여 high throughput 시스템을 구축할 예정입니다.

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