Proteomics를 활용한 Phosphorylation 실험시 고려해야 될 사항들

 

 

 

 

 

PTM 중 가장 많이 분석되고 있는것이 Phosphorylation이라고 생각합니다. Phosphorylation이 생체내에서 다양한 기능을 담당하고 있기 때문이라 생각합니다. 지속적이 질량분석기의 감도의 향상과 더불어 phosphopeptides 을 선택적으로 enrichment 할 수 있는 기술 ( TiO2, IMAC 등)이  많이 개발되었습니다.  이로 인해 이전과는 비교할 수 없는 많은 수의 Phosphopeptide의 검출과 함께 정량분석까지 가능하게 되었습니다. 

 

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이번에는 Phosphopeptide 분석에 있어서 간과하기 쉬운 몇가지를  설명할려고 합니다.

 

 

1)False-positive spectra

 

의뢰자들의 시료분석에 있어서 가장 조심하는 부분중에 하나입니다.  Phosphopeptide  검출결과에 있어서  상당량의 false-positive가 존재합니다. 데이타분석시 1% FDR로 설정을 하더라도 꽤 많은 false-positive 가  나옵니다.   일반적으로 데이타 분석시 특정한 PTM을 설정하면  이상한 스펙트럼에서의 피크들의 여러 조합으로 마치  PTM이 붙어 있는 펩타이드로 결과가 산출될 가능성이 있습니다.    하지만 실제 assign된 스펙트럼을 확인하면 그것이 false-positive 결과임을 알수 있습니다.  아래 스펙트럼은 아주 좋은 Score 로 검출된 phosphopeptide 이지만 실제 검색된 스펙트럼의 모양은 좋지 않습니다. background 수준의 피크들이 assign 되었습니다.

 

 

특정단백질에서의 phosphopeptide를 검출하는 경우 검출되는 false positive 숫자가 상대적으로 적기때문에 수작업으로 가려낼수 있습니다. 그래서 의뢰자들에게 이를 언급합니다.  만약 특정한 phosphopeptide를 선정하여 다음 연구로 넘어갈 경우 미리 알려달라고 합니다. 한번 스펙트럼을 수작업으로 확인한후 적절성 여부를 알려줍니다.  그렇지 않으면 잘못된 결과를 토대로 결론을 도출할수 있기 때문입니다. 하지만 large scale 분석에서는 이것이 불가능합니다. 

 

단일 단백질을 분석할 경우에 간혹  해당 단백질에 해당하는 fasta  sequence만으로 검색하는 경우가 있습니다. 이 경우에는 오히려 false positive 가 더 많이 발생할수 있습니다. S/W는 하나의 protein sequence  만으로 검색하기 때문에 비록  다른 단백질에서 유래된 펩타이드의 경우나 background 피크들임에도 불구하고 억지로  fasta 의 sequence에 매칭할려고 하기 때문입니다.

 

 

 

2. Phosphopeptide 의 enrichment 의 낮은 재현성

 

Phosphopeptide 분석에서는 Enrichment 가 필수적입니다. 하지만  enrichment 과정은 재현성이 완벽하지 않습니다. 그러므로  여러시료를 개별적으로 enrichment 할 경우 정량분석에 있어서 오류가 생길수 있습니다. 가능하면  개별 분석은 최소화 하는것이 좋습니다.  이러한 이유로 TMT 혹은 iTRAQ labeling 방법을 사용합니다. 각각의 시료를 TMT로 Labeling후  혼합후 enrichment를 수행합니다.  시료의  loss가 생길수는 있으나 각 시료의 phosphopeptide의 비율은 유지됩니다.

 

 

3.  단순 단백질양의 변화에 의한 Phosphorylation 변화  

 

 phosphopeptide  정량분석시 enrichment 과정을 거치면서  전체 펩타이드의 대부분을 차지 하는 non-phosphopeptide는 대부분 제거됩니다.  그리고 최종적으로 검출된 phosphopeptide의 정량적인 값을 계산합니다. 하지만 실제로는  phosphopeptide가 포함된 단백질 자체의 양이 변한것일 수도 있습니다.  즉 phosphorylation이 특이적으로 변한것인지 해당 단백질 자체의 양이 변화된것인지 구분하기가 어렵습니다. 그러므로 phosphorylation 연구를 위해서는 phosphopeptide 정량분석과 더불어 전체 단백질의 정량분석도 같이 해야 합니다.  만약 phosphopeptide 분석에서 특정 펩타이드의 양이 변화하였지만 그에 해당하는 단백질(또한 해당 다른 펩타이드)의 양이 동일한 비율로 변화되었다만 이것은 특이적인 phosphorylation 변화가 아닐수 있습니다. 두 분석을 동시에 수행함으로써 phosphorylation의 특이성을 확인할수 있습니다. TMT를 이용한 분석은 이 목적으로 매우 적합합니다.  

 

 

TMT kit의 경우 메뉴얼에  reagent 당 100 ug 단백질까지 labeling  할 수 있다고 적혀있습니다. 2~3배 이상의 양도 가능합니다.  Phosphorylation 연구에서는 한개의 TMT kit 에 최대한 많은 양의 단백질을 적용하여 최대한 많은 양의 phoshpopeptide를 검출합니다. 

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 아래 그림에서와 같이 전체 시료의 5%는 전체 단백질 정량분석에 사용되며 95%는 phosphopeptide enrichment 를 거쳐 phosphorylatin  정량분석에 사용됩니다.

 

 

 

물론 두 트랙에 의해서 검출된 단백질이 모두 겹치지는 않습니다. 하지만 두 트랙에서 동시에 검출된것에 대해서는 보다 더 확실한 결과를 도출할수 있습니다.

 

 

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