IP 시료등 단일 단백질에서 Phosphopeptides 검출시 TiO2 enrichment 사용여부

특정 단백질에서 Phosphopeptide를 검출하는 방법중 가장 감도가 높은 것은 아마 해당 단백질을 IP등으로 분리한후 질량분석를 측정하는것일 껍니다.  종종 의뢰자들이  IP 후 충분한 양의 단일단백질이 얻어졌음에도  예상되는 phosphoppetide가 검출이 되지 않을 때도 있습니다. 이럴때  TiO2 등의 enrichment를 요청하기도 합니다. 원하는 phoshoppetide를 검출하기 위함이겠지요.  하지만 단일단백질에서 Phosphoppetide가 검출이 되지 않은것은 장비의 감도문제가 원인이 아닐것입니다. 

 

TiO2는 large-scale enrichment에 적합합니다. 하지만 IP후에 얻어진 제한된 시료의 양으로 TiO2등을 수행하면 오히려 역효과가 납니다. TiO2 enrichment과정에서 시료의 손실은 피할수 없습니다.  만약 시료의 양이 많은 경우 enrichment 과정에서 비록 손실이 있더라도 다른 non-phosphopeptides에 비해 덜 손실이 일어납니다. 그래서 과량의 시료를 사용하면 이러한 손실에도 불구하고 phosphopeptide를 많이 검출할수 있습니다.   하지만  소량의 펩타이드를 사용할 경우 시료의 손실이 커서 질량분석기로 검출가능한 양의 이하의 양으로 줄어들게 됩니다. 

 

Phosphopeptide를 enrichment 하는 이유는 시료속에 존재하는 대부분의 non-phosphopeptide의 제거하여 phosphopeptide의 시그널을 증대시키기 위해서입니다. 하지만  단일단백질의 경우 tryptic digestion 후에 phosphopeptide의 시그널에 위협을 줄 정도의 펩타이드의 수가 생성되지 않습니다.  이 경우 질량분석기의 넓은 검출영역으로 충분히 해결할 수가 있습니다.  그러므로 TiO2 enrichment는 그다지 도움이 되지 않으며 오히려 시료 손실로 아무것도 검출이 안될수도 있습니다. 

 

 

우리가 잘 알고 있는 대표적인 phosphoprotein인 beta-casein로 간단히 테스트해보았습니다. 

 

 

 

In-solution digestion 후 enrichment 없이 100 ng을 주입한것과  In-solution digestion후 5 µg을 TiO2로 enrichment한후 분석을 비교하였습니다. 추가로 5 µg을  in-gel digestion후 TiO2 없이 분석하였습니다.  아래는 beta-casein 의 대표적인 phosphopeptide이 (FQSpEEQQQTEDELQDK, m/z 1031.4179, 2+) 과 non-phosphorylation form에 대한 MS/MS 스펙트럼입니다.

 

 

아래는 각 과정에서 반복실험한것중 대표적인 크로마토그램입니다.  3개의 크로마토그램의 모양이 상당히 차이가 납니다. 특히 in-solution digesiton후 5 µg을 TiO2를 수행한 크로마토그램의 경우 상대적으로 피크들이 많이 줄어들었습니다. 그리고 보여지는 피크들은 대부분 single charge를 가지는 background 피크들입니다. TiO2 를 통해서 많은  non-phosphopeptide이 제거되었음을 알수 있습니다.

 

 

아래는  beta-casein의 대표적인 phosphopetide (FQSpEEQQQTEDELQDK, m/z 1031.4179, 2+) 대한 XIC 입니다. 해당 펩타이드가 3가지의 방법에서 검출되었습니다. 상대적인  Intensity를 비교해보면 in-solution digestin 후 100 ng을 주입한 시료와 5 µg 을 TiO2로 처리한 시료와 크게 차이가 나지 않습니다. 이론적으로 50배 이상 차이가 나야되지만 그렇지 않습니다.  원인중 하나가  TiO2과정에서 손실이 있기 때문입니다.  5 µg in-gel band에서는 오히려 낮은 intensity를 보였습니다. gel에서 추출하는 과정에서 많은 손실이 있었을 것입니다.

 

 

하지만 Intensity가 낮다고 무조건 나쁘지 않습니다. 비록 intensity가 낮아지더라도 다른 주위의 피크들에 비해서 상대적으로 높다면 검출가능성이 높아지기 때문입니다. 아래는 해당 펩타이드가 용리될때의 MS1 스펙트럼입니다.

단일 단백질이기 때문에 주위의 펩타드에 큰 영향을 받지 않습니다.

 

 

이렇게 단일 단백질에서 phosphopeptide를 검출할때는 TiO2 과정없이 바로 분석하는것이 좋습니다. 만약 검출이 되지 않았다면 Phosphorylation이 되지 않았거나 아주 극미량으로 존재할 경우입니다. 이 경우에는 TiO2 과정을 수행하더라도 검출이 되지 않을것입니다. 

 

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