Orbitrap Fusion의 CID 와 HCD fragmentation 비교

Thermo Scientific 장비를 사용하는 분들이라면 대부분 HCD fragmentation을 사용합니다.  하지만  이전의 Iontrap장비인   LCQ나 LTQ와 같은 장비에는 HCD 방식이 없었습니다.   초기 Orbitrap 장비인 Oribtrap XL부터 HCD가 구현이 되었지만 초창기에는 그 효율이 좋지 않아서 여전히 CID를 사용했었습니다. 하지만 요즈음은 특별한 이유가 아니면 CID를 사용하지 않습니다.  Q-Exactive 시리즈에는 없지만 Orbitrap Fusion 시리즈에는 iontrap에서 CID가 가능합니다.  CID와 HCD의 원리에 대해서는 온라인에서 좋은 자료를 찾을수 있으리라 생각합니다. 

 

 

 

CID의 경우 "low mass cut-off"라 불리는  1/3 rule이 적용됩니다.  이것은 precursor ion의 m/z 의 1/3 보다 적은 값을 가지는 product ion 은 검출이 되지 않는 규칙입니다.  이것은 iontrap이 가지는 특징적인 단점입니다.

 

1/3 rule로 인해서 immonium 이온이나 y1, b1 이온과 같은 적은 m/z값을 가지는 product ion 들이 검출이 되지 않는 경우가 많습니다.  m/z 값이 커질수록 y1, y2, y3 등 검출되지 않는 이온들의 수도 증가됩니다.  물론  이러한 이온들이 검출이 되지 않더라도 다른 이온들이 잘 검출되면 펩타이드를 검출하는데는 문제가 없습니다. 하지만 1/3 rule에서 제외되는 product ion이 해당 펩타이드를 검출하는데 중요한 역활을 할 경우 문제가 될수 있습니다.

예를 들면 y1나 b1 이온에 modification이 된 펩타이드를 검출할때 의미있는 product ion들이 검출이 안될수도 있습니다.  다른 예로는  m/z값이 큰 glycopeptide등을 검출할때 대표적인 immonium ion인 m/z 204, m/z 366등이 검출이 안될수도 있습니다.  또한 대표적인 제한점으로는 iTRAQ / TMT와 같은 정량분석이 불가능하다는 것입니다. 

 

하지만 HCD 구현됨으로써 이러한 단점이 해결되었습니다. CID에 비해서 더 많은 product ion들을 생성할수 있기 때문에 대부분의 분석에서  HCD가 사용되고 있습니다. 

 

 

BSA CID and HCD PRM 

BSA 의 대표적인 펩타이드에 대해서 CID와 HCD 로 PRM을 수행하여 비교해보았습니다. 

아래는LKPDPNTLCDEFK에 대한 CID와 HCD 의 MS2 스펙트럼입니다.  CID에서는 1/3 rule에 의해서 m/z 200 이하는 검출이 되지 않았습니다. 이로 인해 y1에 해당하는 m/z 147.1128 이 검출되지 않았습니다. 반면에 HCD 에서는  검출이 되었습니다. 

 

 

 

 

1/3 rule이 아니더라도 CID와 HCD의 fragmentation 효율이 다를수 있습니다.

아래는 LFTFHADICTLPDTEK 에 대한 CID와 HCD 의 MS2 스펙트럼입니다.  HCD 에서 더 많은 이온이 검출된것을 알수 있습니다.

 

 

HeLa standard CID and HCD DDA

이번에는 200ng standard HeLa digest를 이용하여 CID와 HCD를 비교해보았습니다. 60 min LC gradient 를 이용하여 High-resolution MS 와 low-resolution MS/MS로 분석화였습니다. 아래는 크로마토그램입니다

 

검출된 단백질과 펩타이드 수의 대한 비교 그래프입니다. 단백질의 수는 CID에서 약간 높고 펩타이드 수에서는 HCD가 약간 높습니다.  하지만 차이는 아주 미비합니다.  여러가지 요소가 작용하기 때문에 어떤것이 좋다고 말을 할수가 없을것 같습니다. HCD는 보다 풍부한 MS/MS fragment ion등을 제공하는 반면 iontrap에서의 CID는 HCD에 비해서 상대적으로 속도가 빠릅니다. 

 

아래는 CID와 HCD에서 검출된 펩타이드의 m/z (Da) 분포도입니다.

아래는 CID와 HCD에서 검출된 펩타이드의 이론적인 MH+ (Da) 분포도입니다.

 

Orbitrap fusion에서 High-resolution(MS) / low-resolution (MS/MS)를 사용했을때 검출되는 단백질과 펩타이드의 수에서는 CID와 HCD에 큰 차이가 없는것 같습니다.  하지만 장비의 상태에 따라 결과가 달라질수 있기 때문에 이 결과만으로는 정확히 말할수 없습니다. HCD의 효율이 더 좋은 장비의 경우 HCD에서 더 좋은 결과가 나올수 있습니다. 개인적으로는 CID보다는 HCD를 사용하고 있습니다. 하지만 가끔 HCD fragmentation에 문제가 있을 경우 CID로 분석을 하곤 합니다. 즉 CID로 분석하더라도 단순한 단백질 검출에는 큰 문제가 없을것입니다.