Microbiome 이 제거된 Mouse stool samples 에서 proteome 분석

이전에 사람의 변에서 단백질을 검출해보았습니다 (이전글). 최근에 쥐의 변 시료를 분석할 기회가 있었습니다. 이번에는 사람의 변 시료와는 다르게 microbiome이 제거된 시료도 포함되어있었습니다. 

 

 

 

Data-Dependent Acquisition

아래는 microbiome이 제거된 시료와 포함된 시료를 DDA로 3번씩 분석하였습니다. 아래는 대표적인 크로마토그램입니다.

 

 

아래는 3번의 반복실험에서 얻어진 단백질과 펩타이드수에 대한 그래프입니다. 예상대로 Microbiome이 제거된 시료에서 더 많은 수의 단백질과 펩타이드가 검출되었습니다.

 

 

 

사람의 시료에서 사용했던 gut microbiome DB로 각각 분석을 해보았습니다. 흥미로운것은 microbiome이 제거된 시료에서는 gut microbial 단백질이 전혀 검출되지 않았습니다. 하지만 Microbiome이 제거되지 않는 시료에서는  약 1500개의 microbial protein이 검출되었습니다. 

 

 

Data-Independent Acquisition

Stool 시료를 DIA로 분석하는것에는 많이 제한이 있을것이라 생각합니다. 무엇보다도  microbial protein에서 유래된 펩타이드들이 상당히 많기 때문에 spectra-library를  생성하거나 실제 분석할때 fals-positive가 많이 생길것이라 예상됩니다.  아무튼 DIA분석을 수행해보았습니다.   DIA 분석을 위해서 먼저 EncyclopeDIA 방법을 사용하였습니다.

 

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Gas-Phase Fractionation 과 EncyclopeDIA 을 이용한 DIA 단백질 정량분석

 

아래는 microbiome-free 시료의  Gas-phase Fractionation DIA에 대한 크로마토그램입니다

 

 

microbiome이 포함된 시료와 포함되지 않은 시료를 각각 DIA로 분석한후 EncyclopeDIA로 정량분석을 하였습니다.

아래는 Missing value를 제거한후 얻어진 후 각각의 시료의 technical replicates에서 얻어진 단백질 수에 대한 그래프입니다.  단백질의 수가 거의 유사하게 검출이 되었습니다.

 

상대적으로 많은 펩타이드가 검출된 2개의 단백질에 대한 상대적인 정량값 그래프입니다.

 

하지만 크로마토그래프의 모양이나 DDA에서 검출된 단백질의 수를 고려하면 DIA에서 두 시료가 유사한 단백질의 수가 검출된것이 이해가 되지 않습니다.  보통 DIA 분석은 유사한 종류의 시료에서 특별히 차이나는 소수의 단백질을 검출하는것입니다. 이렇게 상이하게 차이나는 단백질에서는 EnclycopeDIA 프로그램이 어떻게 분석을 했는지 모르겠네요. 오류일수도 있을것 같은데 정확히는 잘모르겠습니다.

 

3번의 DDA와 3번의 DIA 분석에서 검출된 단백질의 평균수는 아래와 같습니다. DIA에서 조금더 많이 검출이 되었습니다. 하지만 이것은 사용된 프로그램이 다르기 때문에 정확한 비교는 될 수 없습니다. 

 

 

 

 

비록 DIA 결과에 대해서는 신뢰할수가 없지만 그래도 Microbiome이 포함되지 않은 시료에 대해서 EncyclopeDIA 분석이 어느정도 가능함을 확인할수 있었습니다.

 

Conclusion

Microbiome이 제거된 시료에 대해  DDA 와 DIA 분석가능성을 확인할수 있었습니다. 차후 서로 다른 조건에서 특이적인 단백질을 검출하는데 도움이 될듯합니다.