Plasma 시료를 Overlap 방식을 이용한 EnclycopeDIA 프로그램방식과 non-overlap 방식으로 Spectronaunt 프로그램 방식을 분석해보았습니다. High abundant proteinds을 제거하지 않으면 검출되는 단백질의 수는 아주 제한적입니다. Plasma 시료에 대한 관련글은 아래와 같습니다.
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Plasma 시료를 trypsin digestion 하여 처음 plasma의 0.05 µL에 해당하는 양을 주입하였습니다. 보통 1 µL당 대략 60 µg의 양이 있음으로 0.05 µL를 주입하면 약 3ug이 주입됩니다.
EncyclopeDIA 분석을 위해서는 Gas-phase fractionation DIA를 수행한후 실제 분석을 위해서 m/z 20 window overlap DIA (m/z 400-1000)를 수행하였습니다. Spectronaut 분석을 위해서는 m/z 20 window non-overlap DIA (m/z 400-1000)를 수행하였습니다. 각각 6번 반복하였습니다. Spectronaut분석시 3가지 방법을 이용하였습니다. 1) 프로그램에서 제공하는 Built-in Spectra-library 2) 직접 사전분획후 DDA를 통해 얻은 Spectra-library 3) Human fasta파일을 이용한 directDIA. Q-Exactive로 분석하였기에 QE-HF 나 QE-HFX에 비해서 검출되는 수는 적을수 있지만 두 프로그램을 비교하는데는 문제가 없습니다.
Protein and Peptide #
아래는 각각의 분석법에서 검출된 단백질과 펩타이드 숫자입니다. 단백질 숫자에서는 EncyclopeDIA가 제일 많습니다. 펩타이드 수에서는 Spectronaut에서 Built-in Spectra-library에서 가장 많습니다.
Missing Value #
아래는 검출된 결과에서 나온 missing value값에 대한 그래프입니다. 단백질의 경우 그 숫자가 아주 미비합니다. 전체 단백질의 수가 많지 않음으로 상대적으로 missing value 수는 많지 않은것 같습니다. 펩타이드의 경우 EncyclopeDIA와 Spectronaunt 가 수 에 있어서 확연히 차이가 납니다. 동일한 시스템에서 Gas-phase fractionation을 이용하여 얻어진 spectra-library를 이용한 검색에서 missing value값이 현저이 줄어듭니다. Retention time을 감안하여 검색하기 때문에 오류가 줄어듭니다. 이러한 missing value값을 고려하게 되면 실제로 검출된 펩타이드의 수는 EncyclopeDIA가 훨씬 높을수 있습니다.
Conclusion
이번 DIA분석에서 EnclycopeDIA가 Spectronaut보다 좋은 결과를 보여주었습니다. 하지만 300개가 넘지 않는 단백질 수에서 비교하는것이 크게 의미가 없을수도 있습니다. 혈액시료의 경우 분석 수가 아주 많은 경우가 있습니다. EncyclopeDIA의 경우 Retention time의 재현성이 아주 중요합니다. 많은 시료를 분석하다 보다 retention time이 달라질수 있습니다. 또한 컬럼의 손상으로 컬럼을 교체해야 될때가 있습니다. 이럴 경우 기존에 생성한 Gas-phase fractionation의 spectra-library를 사용못할수도 있습니다. 또한 기존에 분석한 DIA 결과와 함께 분석할수 없을수도 있습니다. 이러한 시스템적인 불안정요소로 인해 EncyclopeDIA보다 Spectronaut를 선호할때가 있습니다.
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