Lysine(K) 과 Arginine(R)에 결합된 Hexose isobaric peptide 의 characterization

앞에서 언급한 펩타이드의 경우 의뢰자는 R, K에 hexos가 결합된 form을 찾고자 하였습니다. C-terminal의 M은 hsl modification (Δm = -48 Da)이 되어 있습니다.

DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLM

 

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이 펩타이드는 두 개의 K와 한개의 R이 존재합니다. 즉 아래와 같이 3가지 isoform이 존재할수 있습니다.

 

DAEFR(Hex)HDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLM

DAEFRHDSGYEVHHQK(Hex)LVFFAEDVGSNKGAIIGLM

DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNK(Hex)GAIIGLM

 

 

이 세가지의 분자량은 동일하며 또한 크로마토그래피에서 동일한 시간대에 용리되기 때문에 MS1으로는 구분이 불가능합니다. 또한 MS2 fragmentation ion들의 경우도 많은 부분이 겹치기 때문에 구분이 어렵습니다.

 

아래는 Hexose 가 결합되지 않은것과 결합된 펩타이드의 MS1 XIC를 보여줍니다. 두 펩타이드이 용리되는 시간에서 약간 차이가 납니다.

각 펩타이드에 대해 좋은 MS2 스펙트럼을 얻기 위해서 각각의 펩타이드에 대해 PRM를 수행하였습니다.

아래는 두 종류의 펩타이드에 대한 MS2 스펙트럼을 보여줍니다. Hexose가 결합된것과 결합되지 않는 형태의 MS2가 전체적으로 유사하지만 다른 피크들도 많이 보입니다

 

서로 다른 위치에 Hexose가 결합된 3가지의 펩타이드가 한 MS2 스펙트럼에 존재할것이라고 예상됩니다.  이 3가지를 구분하기 위해서는 MS2 스펙트럼에서 각각의 펩타이드에 특이적인 fragment 이온을 찾아합니다. 간단히 그 과정을 설명해보겠습니다. 

 

 

• DAEFR(Hex)HDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLM

이 펩타이드의 존재여부를 확인하기 위해서는 이 펩타이드에 특이적인 MS2 fragment ion들을 찾아야 합니다. 

아래와 같이 Prospector에서 해당한 fragment ion의 m/z값을 확인합니다.  https://prospector.ucsf.edu/prospector/mshome.htm

 

 

 

다른 두 펩타이드과 구별되는 b 이온들을 확인하면 됩니다. 아래는 Raw 파일에서 직접확인한 대표적인 b 이온들입니다. b5, b6, b7에 해당하는 m/z 781.3363, m/z 918.3952, m/z 1033.4211 가 검출이 되었습니다.  이런 방법을 통해 DAEFR(Hex)HDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLM 이 존재여부를 확인할수 있습니다.

 

 

• DAEFRHDSGYEVHHQK(Hex)LVFFAEDVGSNKGAIIGLM

이 펩타이드의 경우 첫번째의 경우 b16(DAEFRHDSGYEVHHQK(Hexose)에서 b27(DAEFRHDSGYEVHHQK(Hexose)LVFFAEDVGSN에 해당하는 MS2 fragment ion들을 검출되어야합니다.  아래는 double charge를 가지는 b16,17,18 에 해당하는 이온들의 피크들입니다.이를 통해서 이 펩타이드가 존재함을 확인할수 있습니다.  Intensity가 상대적으로 낮은 경우 charge state와 10 ppm 이내의 정확도를 확인해야 합니다.

 

 

 

• DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNK(Hex)GAIIGLM

이 펩타이드의 경우 동일한 Lysine에 Hexose가 붙은 형태인 DAEFRHDSGYEVHHQK(Hex)LVFFAEDVGSNKGAIIGLM 과 구별되기 위해서는  y8(K(Hex)GAIIGLM)에서 y19(LVFFAEDVGSNK(Hex)GAIIGLM) 이 검출되어야 합니다. 하지만 수작업을 통해 확인한 결과 발견이 되지 않았습니다.  아마 이 펩타이드는 존재하지 않든지 다른 형태에 비해서 존재량이 매우 적은것으로 생각됩니다.

 

Conclusion

이런 방법을 통해 비록 완벽하게 Characterization은 할수 없을지라도 존재여부는 대략 확인할수 있습니다. 이 결과는 다음 단계로 넘어가는데 유용한 정보를 제공할수 있을것입니다. 예를 들면 특이적인 MS2를 보다 선택적으로 검출할 수 있는 Trriple Quardropole를 이용한 MRM를 수행하면 더 명확한 결과를 얻을수 있을것이라 생각합니다.

 

 

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