실제로 존재하지만 DDA 분석에서 검출되지 않은 펩타이드 확인하기

펩타이드는 존재하지만 다른 펩타이드들과 비교해서 intensity가 낮아서 검출이 되지 않는 경우가 많습니다. Data-dependent acquisition에서 자주 보는 현상입니다.  혹은 MS2가 수행되었지만 MS2의 quality가 낮아서 검색결과에 제외되는 경우도 많습니다. 이럴 경우 실험자는 이 펩타이드를 검출하지 못하는것으로 생각할수 있습니다. 하지만 간단하게 해당  펩타이드의 존재여부를 확인할수 있습니다.

 

 

 

 

 

 

 

아래는 BSA를 DDA로 분석한 크로마토그램입니다.

 

DB 검색을 통해 약 85% sequence coverage를 얻었습니다. 하지만 표시된것 펩타이드(SLGKVGTR)가 검출이 되지 않았는데 이것의 존재여부를 확인해보고자 합니다.

 

 

먼저 이 펩타이드의 m/z에 해당하는 m/z 409.2482 (2+)의 존재여부를 확인합니다. Qual Browser 에서 XIC로  확인할수 있습니다. 

 

약 8분에서  m/z 409.2482(2+)에 매우 근접한 m/z 409.2485이 double charge로 발견이 되었습니다. Full range에서 보이지 않지만 확대하여 보면 해당 피크가 보입니다.  이 펩타이드의 Intensity는 매우 낮다는것을 알수 있습니다. 어떠한 이유로 최종적으로 검색이 되지 않았습니다.

 

SLGKVGTR의 이론적인 MS2 fragment ion들은 아래와 같습니다. 

 

DDA에 해당하는 Raw spectra에서 m/z 409.2485에 해당하는 MS2 스펙트럼이 있는지 수작업으로 찾아보았습니다. 아래와 같이 MS2 스펙트럼을 찾았습니다.  위의 이론적인 fragment ion들이 몇개 보입니다.  즉 MS/MS는 수행되었지만 좋은 스펙트럼을 얻지 못하여 DB 검색시 제외된것 같습니다. 대략적으로 이 펩타이드가 존재한다는것을 예상할수 있습니다.

 

PRM을 통한 재확인

더 확실한 결과를 얻기 위해서 해당 펩타이드에 대해서 PRM을 수행합니다.  동일한 양을 주입했으나 아래와 같이 훨씬 더 좋은 MS2 스펙트럼을 얻었습니다.  이론적인 fragment ion들에 해당하는 피크들이 많이 검출되었습니다. 

 

Skyline 프로그램을 통해서도 재확인할수 있습니다.

 

이런 방법을 통해서 SLGKVGTR가  Database 검색에서는 검출되지 않았지만 추가적인 검증으로 존재여부를 확인할수 있었습니다.