PNGase-F 효소로 N-linked glycopeptide 위치 찾기

당단백질을 PNGase-F (N-Glycosidase F)를 처리하여 분석하는 것은 N-linked glycopeptide site기 위해 가장 널리 사용되는 방법입니다.  PNGase-F는  Asparagine 위치에 붙어 있는 glycan을 선택적으로 제거합니다. 이때 glycan 이 제거되고 나면 Asparagine(N)이 Aspartic acid (D)로 전환되는 deamidation 과정을 거칩니다. 이 두 아미노산의 분자량 차이는 0.98Da 임으로 데이타베이스 검색시 deamidation (N, 0.98Da)을 선택하여 검출합니다. 즉 PNGase-F 를 처리후 asparagine(N)이 deamidation이 되었다면 그것은 이 자리에 glycosylation이 되어있었다는 것을 간접적으로 알 수 있습니다.

 

https://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/articles/biology/glycobiology/n-linked-glycan-strategies.html

하지만 모든 Asparagine에 결합되는것이 아니라 N-X-S/T (X≠P) motif를 만족해야 됩니다. 즉 N  다음 위치에 모든 아미노산이 위치해도 되지만 단  Proline (P) 만은 안됩니다.  또한 두번째 위치에는 반드시 Serine(S) 나 Threonine (T) 가 와야 됩니다. 이것을 만족하지 못하면 비록 Asparagine 이 Deamidaiton이 되었다 하더라도 N-linked glycosylation 의 위치가 아닙니다. Deamidation은 시료 전처리 과정에서도 종종 일어나기 때문입니다.   그러므로 PNGase-F 처리후 결과를 보고 false-positive를 잘 구별해야 됩니다.

 

아래표는 대표적인 혈액 당단백질인 Haptoglobin을 PNGase-F 처리후 얻어진 펩타이드 리스트의 일부분입니다.

아래와 같이 N이 deamidation이 되어있지만 N-X-S/T (X≠P) motif를 만족하지 않은것도 있습니다 (Blue). 이러한 펩타이드는 N-linked glycopeptide site로 간주하지 않습니다.

 

 

추가적으로 VVLHPNYSQVDIGLIK 은 Deamidation이 된것과 그렇지 않는것이 검출되었습니다. retention time도 다릅니다. 원래 glycosylaiton이 되지 않은 펩타이드가 검출되었습니다.

 

아래 피그를 보면 서로 다른 retention time에서 두 펩타이드가 검출되었음을 알 수  있습니다.

두 펩타이드의 MS/MS를 PRM 분석을 통해 얻었습니다.  아래 MS/MS 스펙트럼에서 보듯이 전체적으로 유사한 스펙트럼이 얻어졌지만  Deamidation이 된 부분이 포함된 product ion의 경우 약 0.98Da 차이가 납니다.

 

Database 검색후 검출된  N-X-S/T (X≠P) motif 에 맞는지 그리고 MS2 의 product ion에서 0.98Da 차이가 나는 peak들이 존재하는지 확인하면 됩니다.

 

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