HCD fragmentation 과 Proteome Discoverer 및 Byonic 을 이용한 O-linked glycopeptide 분석

O-linked glycopeptides 분석의 경우 N-linked glycopeptide 분석에 사용되는 PNGAse-F 와 같은 효율적인 enzyme이 없습니다. 하지만 N-linked glycan의 구조에 비해 상대적으로 적은 sugar가 붙은 경우가 많습니다. 이러한 이유로 많은 논문에서 Enzyme을 이용하지 않고  구조분석을 하는 경우가 많습니다.

 

일반 phospho, Acetyl, 그리고 methyl과 같은 PTM의 경우  PTM이 펩타이드 fragment에 결합된 상태로 나오기 때문에 Database 검색이 가능합니다. 하지만 O-linked glycopeptide의 경우 보편적으로 사용하는 HCD에서는 fragmentation 과정에서 glycan이 쉽게 떨어집니다. 그러므로 이론적인 스펙트럼과의 매칭을 통해 결과를 얻어야하는  데이타베이스 검색에서는 잘 분석되지 않습니다.  제한적이긴 하지만 Precursor ion 의 m/z 정보와 glycan이 붙어 있지 않는 펩타이드 backbone의 -b, -y 이온의 정보를 통해 부분적으로 database가 가능합니다. 이러한 이유로 많은 논문에서 ETD를 사용하여 분석합니다. ETD를 이용하면 각 glycan이 붙은 fragment ion들이 나타나기 때문입니다.

 

하지만  ETD 분석은 서비스로 제공하고 있지 않기 때문에 HCD를 이용하여 분석이 가능한지 테스트 해보았습니다. 아래는 Intact peptide(VVLHPNYSQVDIGLIK) 와 O-glycan(( VVLHPNYS(HexNAc)QVDIGLIK) 이 붙은 peptide의 elution retention time 차이를 보여줍니다. 아무래도 Glycan이 결합된 형태가 조금 일찍 용리됩니다.

 

 

Characterization of O-linked glycopeptides in Human Haptoglobin

Human Haptoglobin을 이용하여  분석하였습니다. 250ng digest를 Q-Exactive을 이용하여 스펙트럼을 얻은후 Proteome discoverer 2.4 와 Byonic 을 이용하여 검색하였습니다.

Database Search of O-linked glycopeptides with a Proteome Discovere 2.4

먼저 Proteome Discoverer를 이용하여  검색을 하였습니다.   아래와 같이 Dynamic Modification에  S와 T에 HexNAC 옵션을 추가하였습니다.

 

 

기대를 하지 않았지만  Proteome discoverer 에서  O-linked glycopeptide가 검색되었습니다.

VVLHPNYSQVDIGLIK의 S 에 HexNAc이 한개 와 두개 각각 붙은 형태가 검색되었습니다. 아래는 Proteome Discoverer에서 검색을 통해 얻어진 MS/MS 스펙트럼입니다.

 

VVLHPNYS(HexNAc)QVDIGLIK

 

VVLHPNYS(HexNAc2) QVDIGLIK

완벽하지는 않지만 전반적으로 적절한 Intensity와 matching 된 y,b 이온 수가 나왔습니다. 하지만 앞에서 설명했듯이 HexNAc 이 붙어 있는 fragment ion은 검색이 되지 않았습니다.

 

Manual Characterization of O-linked glycopeptides

데이타베이스 검색이 제대로 되었는지 확인하기 위해서 Manual Characterization을 수행하였습니다.

 

 

 

 

수작업을 통해 얻은 결과와  Proteome Discoverer의 검색결과와 일치함을 확인하였습니다.

단 VVLHPNYS(HexNAc2)QVDIGLIK 의 경우 Proteome Discoverer는 HexNAc이 한개가 떨어진 형태와 b 이온이 결합된 product ion은 검색되지 않았습니다( b11+HeXNAC, b13+HeXNAC, b14+HeXNAC). 이론적인 product가 아니기 때문입니다.

 

Database Search of O-linked glycopeptides with a Byonic

Glycan 분석에 많이 사용되는 Byonic 을 이용하여 검색하였습니다.  Modification 의 Glycan type은 아래와 설정하였습니다.

 

 

 

Byonic에서 얻어진 스펙트럼은 아래와 같습니다.  Byonic에서도 동일하게 Proteome Discoverer에서 검색된 VVLHPNYS(HexNAC)QVDIGLIK 와 VVLHPNYS(HexNAC2)QVDIGLIK이 검색되었습니다.  Proteome Discoverer 와 다른점은 VVLHPNYS(HexNAC2)QVDIGLIK 의 경우 2개의 HexNAC중 하나가 떨어진 형태의 fragment ion들이 검색이 되었습니다. 

 

 

 

 

 

 

MS/MS Spectra at different HCE NCE

앞의 글에서 많은 glycan이 붙어 있는 N-linked glycopeptides의 경우 HCD  NCE에 따라 상당이 다른 형태의 MS/MS 패턴이 나오는걸 설명했습니다. 그래서 N-linked glycopeptides의 경우 stepped NCE를 사용하면 좋은 스펙트럼을 얻는데 도움이 됩니다.  이와 같은 이유로  한개의 HexNAC 이 붙은 O-linked glycopeptide 를 서로 다른 NCE 값으로 분석하였습니다.  여기서 낮은 NCE 값에서 HexNAC이 붙은 fragment ion이 나올지 않을까 예상했습니다. 하지만 HexNAc이 붙은 b 혹은 y ion은 검출되지 않았습니다.  기존에 알려진 대로 HCD가 가진 특성이이며 ETD를 통해서 이를 보완할 수 있을것 같습니다.  스펙트럼상으로는 20 혹은 25에서 가장 좋은 스펙트럼을 얻었습니다. 하지만 이것은 펩타이드 backbone에 따라 다를것이라고 생각합니다.

 

 

 

아무튼 이 실험은 통해서 S 혹은 T 에 적은 수의 HexNAc이 붙은 O-linked glycosylation의 경우  기존의 펩타이드 분석과 동일한 방법으로 검출이 가능함을 확인하였습니다. 양이 충분히 많은 단일 단백질의 경우 분석서비스로도 가능할것 같습니다.

 

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