Byonic™과 Proteome Discoverer를 이용한 N-linked glycopeptides 의 Label-free quantitation 분석

Byonic과 Proteome Discoverer 를 이용하여  Glycopeptides 에 대해 label-free quantitation (LFQ) 를 분석하는 방법입니다.

 

LC-MS/MS of a Haptoglobin glycoprotein (5 Replications)

먼저 당단백질인 human Haptoglobin을 동일한 조건에서 5번의 LC-MS/MS를 수행하였습니다.  Full scan은 m/z 800-1800 이며 전하가 3,4,5 만 MS2가 수행하도록 하였습니다.

 

 

 

Database Search with Byonic-incorporated Proteome Discoverer

1)파일을 불러옵니다.

2)Processing Workflow를 불러옵니다.

3)Consensus Workflow를 불러옵니다.

 

Process Workflow

아래와 같이 process workflow를 만듭니다.  Glycopeptides 분석을 위해서는 Sequence Database Search로 Byonic만 사용해도 되지만 Sequest도 같이 포함시켰습니다.  사실 다양한 Glycan modification에 대한 검색은 Sequest에서 지원이 되지 않기 때문에 glycopeptide가 아닌 일반 펩타이드만 검색이 됩니다. Byonic은 PSM validation이 필요하지 않습니다.Label-free quantitation를 수행해야 함으로 Minora Feature Detector를 추가합니다.

 

Byonic의 mode에서 아래와 같이 glycan modification 옵션을 선택합니다.

 

 

Consensus Workflow

Consensus Workflow는 아래와 같이 설정합니다. Label-free quantitation을 수행해야 함으로  Feature Mapper 와 Precursor Ions Quantifier를 삽입합니다.

아래와 같이 준비가 되었습니다.

 

 

 

 

Study factor 설정

각각의 Run에 대한 정량분석을 위해서는 추가적인 작업이 필요합니다.

Study Factors에서 Biological Replicate factor 에서 아래와 같이 5개의 replicates를 설정합니다. 이름은 마음대로 하면 되며 여기서는 Run01, 02 ,03 ,04, 05로 설정했습니다.

 

 

아래와 같이 Samples 탭에서 앞에서 설정한 이름과 각각의 시료를 매칭시킵니다.

 

Grouping & Quantification 설정

Grouping & Quantification  에서 각 시료를 어떤 조합으로 정량분석을 할지 설정합니다.

아래는 각각의 시료를 개별 replicate로 설정하여 상대적인 정량값이 나오도록 설정했습니다.

 

 

Output

검색결과는 아래와 같습니다.

Database를 Haptoglobin 에 해당하는 fasta 파일만을 사용하였기 때문에 하나의 단백질만 검색이 되었습니다 펩타이드의 리스트 보면 검출된 대부분이 glycopeptide로 나왔습니다. 아마 Full scan을 m/z800-1800 으로 하였고 3가 이상만 MS2를 수행하였기 때문인것같습니다. Normalized Abundance값이 보입니다.

 

검출된 펩타이드(대부분 glycopeptides)의 Relative abundanace에 대한 Boxplot값은 아래와 같습니다.

전반적으로 재현성 있게 나왔습니다.

 

이런 방법을 통해서 서로 다른 시료에서 N-linked glycopeptides의 상대적인 정량값을 구할수 있습니다.

 

 

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