Byonic™ – Protein Metrics 를 이용한 Disulfide bond 분석

 

 

 

 

이전에 Disufide bond 결합을 수작업으로 분석한 내용을 쓴적이 있습니다. 

관련글) BSA를 이용한 Disulfide-linked Peptides 검출법

 

이번에는 Protein Metrics 사의 Byonic 프로그램을 이용하여 Disufide-linked 펩타이드를 검색해 보았습니다. Raw파일은 이전글에 사용한것과 동일한 BSA raw 파일입니다.

 

 

 

 

검색준비

먼저 Byonic 프로그램을 열고 관련된 파일을 업로드 합니니다. 그리고  S-S,Xlink 탭에서 Disufilde 를 체크하였습니다. 물론 일반 modification에서는 Carbamidomethyl (C)는 선택하지 않습니다.

 

"Run"을 클릭하며 검색을 수행합니다. 

결과생성

완료되면 폴더에 아래와 같이 다양한 파일이 생성됩니다.

펩타이드 리스트 파일

BSA_onlyTrypsin.xlsx

0.15MB

 

생성된 파일 중에 PMI-Byonic Viewer를 클릭하면 검색된 결과를 한눈에 볼수 있습니다. 

많은 BSA에서 유래된 펩타이드가가 Disulfide 결합이 된것을 볼 수 있습니다.   하지만 각각의 펩타이드를 클릭하여 아래 MS/MS  spectrum을 보게 되면 그다지 좋지 않은 spectra도 많이 보입니다.  아마 이것들은 false positive 결과 인것 같습니다. 예를 들어LKPDPNTLCDEFK.A 와 K.YNGVFQECCQAEDKGACLLPK 가 결합된 펩타이드의 MS/MS  스펙트럼은 아래와 같습니다. 좋지 않아 보입니다. Precursor ion의 실제 m/z값은 855.7965 (5+)이나 m/z 855.9999(5+)로 계산되었습니다. 

 

하지만 이전에 수작업으로 계산한 스텍트럼인 Intra-link 형태인 K.LVNELTEFAKTCVADESHAGCEK.S은 아주 적절하게 잘 검색된것같습니다. 아래 스펙트럼에서 보듯것과 같이 충분한 fragment ion들이 존재합니다.

 

다음으로 Reduction/Alkylation을 수행한 BSA를 위에서 사용한 동일한 파라미터로 검색해보았습니다. 이론적으로 disulfide 결합이 없어야 되는데 많은 펩타이들이  disulfide 결합된 형태로 검색되었습니다. 

 

BSA_DTT-IAA-Trypsin.xlsx

0.11MB

 

Reduction/Akylation 이 완전히 진행되지 않아서 생긴 결과 일 수 도 있으나 스펙트럼상으로 보면 false-postive일 가능성이 높습니다.

 

결론

Disulfide 결합된 펩타이드의 경우 충분한 fragment ion이  생성되지 않기 때문에 database가 완벽하게 구현이 되지 않을 것입니다. 하지만 얻어진 결과를 토대로 조금만 수작업을 한다면 의미있는 결과를 산출 할수 있으리라 생각합니다. 먼저 MS2 스펙트럼을 체크하여 좋은 것들만 선정한후에  수작업으로 추가 검증하면 좋을것 같습니다. 프로그램이 전체 스펙트럼중에서  후보 펩타이드를 골라주는 역활만으로 연구자의 시간과 노력을 많이 줄여 줄 수 있습니다.