수작업으로 N-linked glycopeptides 구조분석하기

이번에는 수작업으로 N-linked glycopeptides의 구조를 분석하는 법을 설명해보겠습니다.

 

이전에 글에서 PNGase-F 를 이용한 N-linked glycosylation site 찾는법 과 Intact N-linked glycopeptide를 스펙트럼에서 찾는법을 설명하였습니다.

 

 

N-linked glycopeptide의  구조분석하기

이 방법을 토대로 N-linked glycopeptide의  구조를  수작업으로 분석해보겠습니다.

먼저  앞의 글에서 설명한 대로  시료가 준비되어야 합니다. 즉 원하는 펩타이드 backbone이 용리되는 시간을 알고 있어야 됩니다.  또한 PNGase-F를 처리하지 않은 단백질을 분석하여  스펙트럼을 얻어야 합니ㅏㄷ.

 

대표적인 N-linked glycopeptide의 Precusor ion 의 m/z 계산하기

Human에 존재하는 N-linked glycan은 대표적으로 아래와 같이 3가지 형태를 가집니다. 

수작업으로 피크를 찾기 위해서는 해당되는 precursor ion들의 m/z 값을 알고 있어야 합니다.  예상되는 N-linked glycopeptides가 실제 spectrum에 존재여부를 확인하기 위합니다.  이를 위해서 아래와 엑셀파일을 이용하여 precusor ion 의 m/z를 구합니다.  테이블은  3가지 glycan 형태에 따라 변경하면 됩니다. 일단 Complex 형태로 진행해보겠습니다.

 

노란색부분에 펩타이드 시퀀스에 해당하는 monoisotope peak의  m/z를 기입합니다. montoisotope peak m/z 는 ProteinProspector 툴을 이용하여 계산할 수 있습니다. VVLHPNYSQVDIGLIK 의 monoisotope mass 인 1795.0112를 적습니다. 테이블에서 이론적으로 가능한 대표적인 human N-linked glycan 구조의 조합+펩타이드에 대한 m/z값이 전하별로 나옵니다. 

 

테이블다운로드

Glycopeptide_Analyzer_Haptoglobin.xlsx

0.05MB

 

 

여기서 대표적인 구조인  HexNAc(4)Hex(5)이 붙은 형태를 보겠습니다.  이 glycan 구조의 분자량은 1623 Da 이며 1794.00393 Da인 VVLHPNYSQVDIGLIK 과 결합하여 이론적인 monoisotope m/z 값이  3417.5929 이 됩니다.  이중 3가 전하인 m/z 1139.8691을 선택합니다.

 

XIC를 이용하여 스펙트럼에서 N-linked Glycopeptide 찾기

m/z 1139.8691를 이용하여 10ppm 이내에서 precursor ion를 찾습니다. 아래 스펙트럼(하단)에서 보듯이  1139.8704 (3+) 이 나옵니다.   PNGase-F를 처리한후 검출된 펩타이드(상단)와 유사한 retention time을 가집니다. 

 

 

Precursor ion 피크를 확대하였습니다. 약 1.13 ppm 오차입니다.  

이 방법으로 찾아진 대표적인 다른 N-linked glycopeptides에 대한 XICs는 아래와 같습니다. 예상대로 유사한 retention time에서 용리되고 있습니다.

 

MS2  스펙트럼을 이용한 구조분석하기 

이제 본격적으로 MS2 스펙트럼을 이용하여 구조분석을 해보겠습니다.  해당 precursor ion에 대한 MS2 스펙트럼은 Data-dependent acquisition (DDA) 혹은 Parallel reaction monitoring (PRM)을 이용하여 얻습니다. 정확한 분석을 위해서는 PRM을 이용하여 깨끗한 MS2 spectrum을 얻는것이 좋습니다.  아래 스펙트럼은 1139.8704 (3+)에 대한 MS2 스펙트럼입니다. HCD 와 CID fragmentation에서 N-linked glycopeptide의 경우 일반 펩타이드와 달리 펩타이드 backbone이 절단되는것이 아니라 glycan이 연속적으로 떨어지는 형태로 나타합니다.   펩타이드 자체의 fragmentation은 거의 보이지 않거나 몇개만 보입니다.

 

먼저 대표적인 glycan 의 oxoniumm ion인 m/z 204 와 m/z 366 이  왼쪽에서 보입니다. 그리고 스펙트럼에서 오른쪽에 보이는 높은 intensity를 가지는 피크들이 펩타이드에 glycan이 붙어있는 형태들입니다. 

 

각각의 피크들과 일치하는 m/z값을 아래 테이블에서 찾아서 확인합니다.  반드시 monoisotope 피크를 선택해야 되며 10 ppm 이내에서 찾아야 합니다.   스펙트럼과 일치하는 피크들을  테이블에서 빨간색으로 표시하였습니다. 

 

아래는 최종적으로 분석한 스펙트럼입니다.

 

중간부분을 확대하면 많지는 않지만 펩타이드의 backbone에 해당하는 product ion도 몇개(노란색) 찾을수 있습니다.

 

 

최종적으로 아래 항목이 모두 만족되었습니다.

• 펩타이드 backbone 의 retention time 과 유사
• 10 ppm 이내의 precursor ion m/z
• 10 ppm 이내의 다양한 펩타이드+glycans  product ions
• 몇개의 펩타이드의 y ions

 

관련글

FAIMS를 이용하여 선택적으로 N-linked glycopeptides 검출하는 방법

In-source fragmentation (CID) for N-linked peptide Characterization

In-source fragmentation (CID) for N-linked peptide Characterization

Monoclonal Antibody (mAb)에서 Intact N-linked glycopeptides 분석

Monoclonal Antibody (mAb)에서 Intact N-linked glycopeptides 분석

HCD fragmentation 과 Proteome Discoverer 및 Byonic 을 이용한 O-linked glycopeptide 분석

Glycopeptides 구조분석을 위한 stepped NCE fragmentation

Byonic™ – (Protein Metrics)로 N-linked glycopeptides 분석하기

수작업으로 N-linked glycopeptides 구조분석하기

PNGase-F 효소로 N-linked glycopeptide 위치 찾기

N-linked glycopeptides 가 C18 Chromatography에서 상호작용하는 원리PNGase-F 효소로 N-linked glycopeptide 위치 찾기