Lysine acetylation 펩타이드의 경우 MS/MS에 특정한 immonium ion이 생성됩니다. Acetyllysine의 Immonium ion 인 143.1179 Da 과 ammonia가 떨어진 형태이 126.0913 Da 이 생성됩니다. 이것은 Acetyl lysine 을 확인하는데 Diagnostic ion 으로써 사용될수 있습니다.
Orbitrap Fusion의 경우 MS2 스펙트럼에서 Diagnostic ion이 발견되면 ETD와 같은 추가적인 분석을 수행할수 있습니다. Targeted mass Trigger 기능을 이용하면 됩니다. Diagnostic ion 인 126.0913 Da 에 대해서 Targeted Mass Trigger 를 설정하면 MS2 스펙트럼에서 m/z 126.0913을 생성한 precursor ion에 대해 추가적인 분석을 할수 있습니다.
Acetylated BSA
Sigmaaldrich에서 구매한 acetylated-BSA를 이용하여 테스트를 해보았습니다. 펩타이드 Sequence중에 Lysine에 Acetylation이 된 펩타이드가 존재합니다. K(Acetyl)VPQVSTPTLVEVSR (m/z 561.3210. 3+)
아래는 K(Acetyl)VPQVSTPTLVEVSR의 HCD MS2 스펙트럼입니다. Low m/z 영역에 acetylated lysine에 해당하는 immonium ion 두 개가 검출이 되었습니다.
Orbitrap Fusion에서 targeted mass trigger 를 설정하는 방법입니다.
HCD MS2 스펙트럼에 diagnostic ion에 해당하는 126.0913 이 검출되면 해당 precursor 에 대해서 두번의 ETD를 수행하도록 설정하였습니다.
아래는 acetylated BSA의 크로마토그램입니다.
아래와 같이 HCD에서 126.0913이 검출된 m/z561.3208에 대해 두번의 ETD가 수행되었습니다(Scan number 2937, 2938).
Histone
Histone은 Acetyl, Methyl, and Phospho PTM이 아주 많이 결합되어 있습니다. 하나의 펩타이드에 여러개의 PTM이 붙어 있거나 혹은 동일한 PTM이지만 서로 다른 위치에 결합되어 있는 경우가 많습니다. 이 경우 정확한 Site를 확인하기 위해서는 HCD와 ETD를 동시에 분석하면 도움이 됩니다.
위의 방법으로 Propionylation이 된 Histone 시료를 분석해보았습니다. 아래는 Base-peak chromatogram입니다.
많은 ETD가 수행된것을 볼수 있었습니다. 예를 들면 다음과 같은 펩타이드 K[Acetyl+Propionyl]STGGK[Propionyl]APR (m/z 528.2958, 2+) 가 HCD에서 diagnostic peak가 검출되었고 다시 ETD로도 분석이 되었습니다.
Conclusion
물론 HCD만으로도 충분한 결과를 얻을수 있습니다. 하지만 만약 HCD 만으로 정확한 acetylated site를 찾는데 어려움이 있다면 ETD로 추가 분석을 하여 결과를 얻을수 있습니다.
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