특정 소수의 단백질로 인해 TMT Phosphopetide 정량분석의 어려움

조직에 따라서 소수의 특정 종류의 단백질들이 전체 단백질에서 많은 양을 차지 하는 경우가 있습니다. 이 경우 단백질의 정성과 정량분석에 어려움이 있습니다.

 

몇년전에 쥐의 다리 근육조직을 이용하여 TMT 정량분석을 하였습니다.  서로다른 조건에서 반복실험해서 얻은 8개의 Tibialis anterior (경골앞면?) 조직으로 TMT 정량분석을 수행하였습니다.   단백질의 전체 정량분석과 더불어 TiO2를 이용하여 Phosphorylation의 변화를 동시에 측정하였습니다. 검출된  단백질과 펩타이드의 수는 아래와 같습니다.  일반적으로 검출되는 단백질의 수인 4,000~5000개의 단백질수에 못미치는 숫자입니다.

 

이유는 다음과 같습니다.  특별히 근육수축을 담당하는 단백질중에 Titin이라는 한개의 단백질 양에서 많은 비율을 차지하기 때문입니다. 또한 약 400 kDa 을 가지는 아주 큰 단백질입니다. Tryptic digestion을 하게 되면 매우 많은 수의 펩타이드일 생성됩니다.  이로 인해 다른 단백질들이 검출되는것에 어려움이 생깁니다. 

 아래는 검출된 전체 펩타이드 수와 Titin에서 검출된 펩타이드 수를 보여줍니다. 약 20%를 차지합니다. 많은 양의 Titin 단백질에서 생성된 phosphopeptides들로 인해 다른 단백질의 phosphopeptide를 검출하는데 어려움이 있습니다.

 

아래는  주어진 시료에서 검출된 단백질의 상대적인 양을 Normalization한 결과입니다.

한개의 단백질이 Titin이 검출된 전체 단백질의 약 20% 차지합니다.  또한 근육조직에서 상당히 많이 존재하는 Myosin inform 포함 11개의 단백질이 약 16% 를 차지합니다.  나머지 1053개의 단백질 합이 64%를 차지합니다. 정량값이 0에 가까운 244개의 단백질이 총 0.01%를 차지하고 있습니다. 

Phosphopeptide의 정량분석에 있어서 중요한것은 실제 단백질 자체의 변화가 아닌 Phosphorylation 특이적인 변화를 관찰해야 합니다.   이러한 이유로 전체 단백질의 변화화 함께 Phosphopeptide의 정량분석을 동시에 수행하여 비교해야 합니다.  두 결과를 비교하여 phosphorylation의 증감이 단백질 자체의 변화에 따른것인지 Phosphopeptie 특이적인지 확인할수 있습니다.  하지만 이 시료의 경우 특이한 성질로 인해 두 분석에서 동시에 검출된 단백질이 상대적으로 적었습니다.  이로인해 Phosphopeptide의 변화 특이성을 확인하는것이 어렵습니다. 

 

 

아래는 검출된 총 Phosphopeptide 중에서 Titin의 phosphopeptide의 수를 보여줍니다. 한개의 단백질에서 71개의 phosphopeptide가 검출되었습니다. 약 10% 를 차지합니다. TiO2 enrichment 과정에서 상대적으로 양이 많은 Titin phosphopeptides의 결합력이 높아서 낮은 농도로 존재하는 다른 phosphopeptide들의 결합력이 떨어질수 있습니다.

 

Conclusion

위의 실험결과처럼 특정 단백질이 상당히 많이 차지 하는 시료의 경우 보일수 있는 어려움을 살펴보았습니다.

 

 

 

 

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