짧은 LC gradient로 단일단백질 검출하기

IP 시료와 같이 단일 단백질 혹은 소수의 단백질이 포함된 시료의 경우 굳이 긴 LC gradient를 사용하지 않아도 됩니다. 물론 장비의 시간에 제한이 없을 경우는 상관없습니다. 하지만 시료의 수가 많고 장비의 시간에 제한이 있을 경우 원하는 단백질을 확인하는 수준이라면 짧은 LC gradient로도 충분합니다.

 

 

 

일반적으로 원하는 단백질을 검출하기 위해서 IP를 수행합니다. 이때 100% 단일 단백질만이 회수되지는 않습니다. 하지만 만약 IP가 잘 수행되었다면 시료의 대부분이 목표단백질이 차지할것이며  나머지 소량의 단백질이 포함되어 있을것입니다.

 

SigmaAldrich에서 판매하는 BSA power를 in-solution digestion하여 분석해보았습니다. 보통 판매되는 이러한 단백질은 순도가 100%가 되지 않기 때문에 질량분석기로 분석하며 다른 소량의 단백질이 많이 검출됩니다. 일반적으로 IP를 수행한후 얻어지는 순도가 되지 않을까 생각합니다.

 

20 min vs 60min LC gradient

200ng BSA를 동일한 질량분석기 조건에서 20min gradient와 60min gradient로 각각 분석하였습니다. 아래는 각각의 크로마토그램입니다.

 

 

60min LC Gradient for 200ng BSA

 

 

Peptide #  and Sequence Coverage

각각의 분석에서 얻어진 BSA의 펩타이드의 숫자와 Sequence coverage입니다. 아래 그래프에서 보듯바와 같이 큰 차이는 없습니다.  짧은 LC gradient에서도 높은 sequence coverage를 얻었기 때문에 60min LC gradient에서의 결과와 큰 차이가 없습니다.

 

 

Conclusion

단일 단백질의 경우 분석할 시료수가 많거나 장비의 시간이 제한된 경우는 이렇게 짧은 LC gradient를 추천합니다.

만약 긴 LC gradient를 사용하게 되면 피크들이 잘 분리됩니다.  하지만 LC gradient가 짧아지게 되면 상대적으로 peak width가 좁아지게 되어 피크의 intensity가 증가 됩니다. 더 좋은 MS2 스펙트럼을 얻을수 있습니다. 최근의 질량분석기는 속도가 매우 빠르기때문에 단일 단백질에서 유래된 펩타이드의 수는 LC gradient의 길이와 상관없이 대부분 검출할수 있습니다. 

 

욕심을 조금 버리면 퇴근을 더 일찍 할 수 있습니다.