단일 단백질 검출시 Dynamic Exclusion 기능 없이 분석하기

• DDA 분석에서 Dynamic Exclusion은 반드시 필요한 파라미터입니다. 이 기능을 사용하지 않으면 Intensity가 높은 피크들이 중복되어 분석되기 때문에 낮은 intensity를 가지는 피크들은 검출이될 기회가 줄어들게 됩니다. Complex 시료에서 상대적은 양이 적은 펩타이드를 검출하기 위해서는 반드시 사용해야할 기능입니다.

 

• 하지만 펩타이드의 수가 그렇게 많지 않은 단일 단백질의 경우에는 어떨지 궁금합니다. 특별히 Orbitrap 장비에서 Data dependent Mode에서 "Cycle time" 기능이 있습니다. 주어진 시간동안 MS1에서 검출된 피크들을 가능한 많이 MS2를 수행합니다.

 

• 단일 단백질에서 얻어진 펩타이드의 수는 그다지 많지 않을 뿐더라 LC 를 통해 분리되기 때문에 특정 시간에 검출되는 펩타이드의 수는 적을 것입니다.  그러므로 이 cycle time 기능이 있으면  Dynamic exclusion 기능을 사용하지 않더라도 특별히 손해볼것이 없을듯 합니다.
•   100fmol BSA와 Enolase standard를 Dynamic Exclusion을 사용한것과 사용하지 않은 조건에서 분석해보았습니다. FAIMS를 장착한 상태에서 분석하였습니다.

 

 

 

 

• 아래는 검출된 펩타이드의 수와 PSM 수입니다.

 

 

 

 

 

• 검출된 펩타이드의 수에는 큰 차이가 없습니다. Dynamic exclusion을 사용하지 않아도 큰 차이가 없는것 같습니다. 하지만 PSM 수에서는 상당히 차이가 많이 납니다.  Dynamic Exclusion을 사용하지 않으면 해당 펩타이드들이 여러번 반복해서 검출이 되기 때문일듯 합니다.
• 특별히 Enolase standard에 포함된 di-phosphopeptide (VNQIGTLS(p)ES(p)IK) 에 대한 결과를 확인해보았습니다.  Proteome  Discoverer에서 검색된  MS/MS 스펙트럼을 비교해보았습니다. 아래에서 보듯이 Dynamic Exclusion을 하지 않은 조건에서 더 좋은 MS/MS 스펙트럼이 얻어진것 같습니다

 

Dynamic Exclusion ON

Dynamic Exclusion OFF

 

• 정확한 이유는 알지 못하겠지만 Dynamic exclusion을 사용하지 않으면 해당 펩타이드가 용리되는 동안 여러번 MS/MS가 수행될것입니다. 이로 인해 피크의 높은 위치에서 MS/MS가 수행될 확률이 높게 됨으로 좋은 스펙트럼을 얻은것이 아닐까 생각합니다.

 

• 이번에는 100fmol BSA 와 10fmol Enolase를 혼합하여 분석하였습니다. 여기서는 Dynamic Exclusion에서 FAIMS의 기능인 Shared Dynamic Exclusion을 사용한것(Shared)과 사용하지 않은것(NoShared)을 포함시켰습니다.  아래의 그래프에서 보듯이  BSA에 비해서 상대적으로 양이 적은 Enolase 펩타이드의 수의 경우도 Dynamic exclusion 을 사용하지 않더라도 큰 차이가 없습니다. 상대적으로 높이가 낮은 피크들도 큰 문제없이 검출됩니다.

아마 Orbitrap Eclispe의 "Cycle time" 기능이 잘 작동하기 때문에 Dynamic exclusion 기능을 사용하지 않아도 단일단백질에서 유사한(혹은 조금 좋은) 결과가 나온것 같습니다.  만약 단일 단백질을 검출할 실험이 있다면 Dynamic Exclusion을 사용하지 않고 DDA의 Cycle time mode로만 검출을 해보아도 좋을것 같습니다.