Orbitrap Eclipse에서 Turbo TMT 기능

• 최근 Orbitrap 장비에는 Turbo TMT 기능이 있습니다. TMT reporter ion 들의 m/z영역만을 선택적으로 Resolution을 증가시키는 기능입니다.   

 

• TurboTMT intelligent acquisition based on novel ΦSDM spectral processing increases resolution to baseline resolve TMT reporter ion isotopologues and speeds up a spectral acquisition for TMT 11plex experiments, thereby increasing throughput for identification of quantifiable peptides (From Thermo Website)

 

 

 

• TMT-10plex 이상의  시료를 분석하기 위해서는 최소 MS2의 resolution은 50K 이상의 분리능이 필요합니다.  일반적으로 펩타이드 backbone을 검출하기 위해서는 높은 분리능이 필요하지 않지만 Reporter ion들을 분리하기 위해서는 어쩔수 없이 높은 분해능을 사용해야 합니다.  Turbo TMT  기능은 MS2에서  15K 혹은 30K  분해능을 사용하지만  TMT reporter ion 영역만  추가적인 시간을 사용하지 않고 선택적으로 분리능을 높여줍니다. 이 기능을 통해   Protein coverage를 높일수 있습니다.    이 기능의 목적상 MS2의 분리능이 15K 와 30K에서만 허용되고 그 이상에서는 사용할수 없습니다.  높은 분리능에서 이러한 기능을 사용할 이유가 없기 때문입니다.

 

 

• TKO TMT11  Yeast standard를 이용하여 이 기능이 실제로 유용한지 테스트해 보았습니다. 

관련글

Orbitrap Eclipse의 MS3 SPS Real-time search를 활용한 TMT 분석 (TKO TMT 11-plex standard) (tistory.com)

 

•  TMT-MS2와 TMT-MS3 Real-time search 모드에서  이 기능을 사용하지 않은것과 사용하였을때의 단백질 및 펩타이드 수를 비교해보았습니다.  Turbo TMT는 MS2의 resolution을 15K와 30K를 각각 사용하였습니다. 이 기능은 아마 TMT MS2방식에 더 효과적일듯합니다. TMT MS3방식에서는 iontrap으로 MS2를 수행하고 MS3는 Reporter ion 영역만 분석하기 때문에 Turbo TMT 의 기능이 필요없을듯합니다.

 

• 아래는 각각의 분석방법에서 얻어진 단백질과 펩타이드 수입니다. 안타깝게 TMT2 Turbo 30K에서 Spray voltage값을 잘못입력하여 결과를 얻지 못했습니다.

• Turbo TMT 기능을 선택할때 특별히 다른 조건을 바꾸지 않고 MS2의 Resolution만 바꾸었습니다.  일단 위의 결과를 토대로 보면 Turbo TMT  의 기능에서 큰 효과를 확인하지 못했습니다. 오히려 검출수가 적습니다. 기존의 문헌의 결과와 다른 결과를 보입니다. 아마  Turbo TMT 기능을 잘 활용하기 위해서는 아마 다른 조건을 최적화해야되는듯합니다. 혹은 더 복잡한 시료에서 확연한 결과를 보여줄수 있을지도 모르겠습니다.

 

• Thermo 에서 Turbo TMT 를 비교한 결과가 있습니다. 여기서는 Turbo TMT를 사용함과 동시에 FAIMS도 설치한것이라 Turbo TMT만의 효과를 설명하고 있는지 모르겠네요.  한가지 발견한것은 120min LC gradient이하에서 효과가 있다는것으로 보아 아마 complexity가 높은 상태에서 더 효과적인것 같습니다.

po-65541-tmt-quantitation-quadrupole-orbitrap-ms-asms2019-po65541-en.pdf

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• 그래서 위에 실험했던 시료를 TMT MS2 방법에 한하여 40 min LC gradient로 분석하였습니다. 짧은 Gradient로 인해 주어진 시간에 더 많은 펩타이드가 용리됩니다.  분석후 Proteome Discover로 검색하였습니다. 아래 그래프에서 보듯이 이번에는 Turbo TMT MS2(15K resolution)에서 더 좋은 결과가 얻어졌습니다.

 

이렇게 결과가 확연히 바뀔것 같지 않은데 실험과정에서  잘못이 있는지도 의문이 듭니다.