Vanquish Neo에서 Direct injection mode 로 검출수 높이기

• 대부분의 실험실에서 Nano HPLC 시스템에 Trap-column을 장착하여 사용합니다. Trap-column의 효용성은 널리 잘알려져 있습니다. 특히 Analytical column으로 분석하기전 시료를 정제하고 농축하는 기능이 있습니다. Analytical column을 보호할뿐만 아니라 장비의 오염의 최소화 할수 있습니다.  또한 높은 유속(5~10 uL/min)으로 시료를 Loading하는 기능이 있습니다. 만약 Nano Analytical column에 5uL의 시료를 바로 주입하게 되면 300nL/min의 유속으로 거의 20분에 가까운 시간이 소요됩니다.

 

 

• 하지만 Trap column없는 Direct injection의 유용성도 많습니다. 무엇보다도 모든 시료가 바로 Analytical column으로 주입되기 때문에 시료의 손실을 최대한 줄일수 있습니다. 이론적으로 보면 Trap-column에 결합하지 않는 펩타이드는 Analytical column에서 결합하지 않기 때문에 두 가지 방법에서 차이가 없어야 됩니다. 하지만 실제는 Trap-column에서의 손실이 약간 더 큽니다.  많은 논문에서 극미량의 시료를 분석할때 trap-column을 사용하지 않고 Direct injection 방법으로 사용하는 이유입니다.

 

 

• 하지만 Nano HPLC 시스템에 따라  trap-column없이 Direct injection으로 셋팅하는것이 쉽지 않습니다. 그러나 Easy nLC나 Vanquish Neo의 경우 Trap-column 과 Direct Injection mode를 쉽게 변경할수있습니다. Script 를 이용하면 스크린에서 그림과 함께 tubing을 교체하는 과정이 상세히 나옵니다.

 

 

 

 

• Direct injection mode에서는 loading되는 시간을 줄이기 위해서 Loading 과정에서 유속이나 압력을 최대치까지 올려서 시간을 줄일수 있습니다. 특히 Vanquish Neo에 Viper tubing이 연결된 EasySpray 컬럼을 장착할 경우 높은 압력/높은 유속에도 Sample Loading이 가능합니다.   시료가 깨끗이 잘 전처리되었을 경우 Direct injection을 통해 감도를 높일수 있습니다.

 

• 아래는 동일한 조건에서 Trap-column을 장착했을때와 Direct injection으로 했을때의 크로마토그램입니다. Trap-column이 없으면 Void volume이 줄어들게 됨으로 동일한 LC gradient 조건이라면 약간 더 일찍 용리됩니다.

 

• 검출된 단백질과 펩타이드의 수를 비교해보았습니다. 예상대로 Direct injection mode에서 조금 더 많은 단백질과 펩타이드가 검출되었습니다.   물론 결과는 Trap-column의 상태에 따라 달라질수 있습니다. 만약 효율이 좋은 Trap-column을 사용할 경우 검출수의 차이가 줄어들것이라 예상합니다.