FAIMS를 이용하여 1ng HeLa 시료 DIA로 분석하기

극미량의 분석에 있어서 FAIMS 장비는 단백질 검출에 상당한 도움을 줍니다. 현재 셋팅된 장비를 이용해서 DDA분석에서 약 2000개의 단백질을 검출할수 있습니다.

 

 

Orbitrap Eclipse + FAIMS로 단백수/펩타이드 검출수 증가시키기 (tistory.com)

Orbitrap Eclipse + FAIMS로 단백수/펩타이드 검출수 증가시키기

Direct injection mode 로 1ng HeLa로 2000개 단백질 검출하기 (tistory.com)

Direct injection mode 로 1ng HeLa로 2000개 단백질 검출하기

 

이번에는 정량분석을 위한 DIA분석을 해보았습니다. 사실 1ng정도의 양으로 DIA를 분석할 일은 거의 없을듯합니다.

1ng시료의 분석조건을 최적화 하는것보다 시료의 양을 증가시키는것이 훨씬 더 나을것입니다.  하지만 만약을 위해서 기존의 분석조건에서 몇가지를 바꾸어서 분석해보았습니다. DDA에서는 120min LC gradient을 사용하였지만 DIA에서는 60 min LC gradient를 사용하였습니다. 

 

 

아래는 각 방법에서 검출된 단백질 및 펩타이의 수입니다. 2500개의 단백질이 가장 많은 수입니다.

 

하지만 DIA를 이용한 정량분석에서는 정량성도 고려해야 함으로 Data points도 같이 고려해야 합니다.  1ng 시료의 경우 많은 data point를 얻기는 쉽지 않는것 같습니다. 아래와 같이 분석방법에 따라 평균 data-point수가 다양합니다.

 

 

Data-Points
Data-point를 증가시키는 방법중 하나는 Isolation window구간을 줄이는것입니다.  아래는 1ng와 100ng의 HeLa 시료를 DIA로 분석했을때 m/z구간 별로 검출된 단백질수의 비율입니다. 1ng의 경우 m/z800 이상에서는 거의 검출이 되지 않은것을 알수 있습니다.  이러한 점을 고려할때 m/z800 이하까지만 분석하게 되면 동일한 조건에서 data point 수를 약간 증가시킬수 있습니다.

 

 

 

30min vs 60 min LC time

분석시간을 줄이기 위해서 30min LC gradient를 사용해보았습니다.  아래 그래프에서 보듯이 검출수는 거의 차이가 나지 않지만 Data-point가 상당히 적습니다. 즉 지금조건에서 30min LC gradient의 경우는 정량분석으로 적절하지 않습니다.