Top-down proteomics 를 시작해볼까 구상중입니다. Bottom-up Proteomics처럼 Complex 시료는 분석할수 없겠지만 몇개의 정제된 단백질의 경우 Top-Down Proteomics로 분석할수 있을듯합니다. 연구소에서도 요청이 들어오고 있습니다.
10월에 시카고에서 열렸던 Top-Down Proteomics Workshop을 다녀온후 조금씩 시도를 해보고 있습니다.
아래 프로토콜 처음시작하는 사람들에게 아주 좋은것 같습니다.
Self-packing PLRP-S Column and NRTDP Standards
프로토콜에 나온 PLRP-S resin Agilent에서 구매한후 Self-packing 컬럼을 만들었습니다. Standard 시료도 논문에 있는것과 같이 준비하였습니다.
PLRP-S for Biomolecules | Polymeric Reversed-Phase HPLC Columns | Agilent
특히 중요한건 DB Search Platform입니다. 일단 Proteome Discoverer 3.1과 ProSight 4.3 Trial 버젼을 다운받아서 분석했습니다.
아래는 Nano LC system에서 얻어진 크로마토그램입니다. 예상대로 피크가 매우 넓습니다. 논문을 보니 아주 좋은 피크모양이 나오는데.. 직접해보니 잘되지 않네요.
ES907 EasySpray Column and Intact Protein Standard
컬럼도 단백질용 EasySpray컬럼 (ES907)를 구매해서 분석해보았습니다.
EASY-Spray™ HPLC Columns (thermofisher.com)
이번에는 Pierce 사의 Intact Protein Standard를 구매하였습니다.
Pierce™ Intact Protein Standard Mix (thermofisher.com)
Self-packing PLRP-S Column 과 비교했을때 아주 좋은 크로마토그램이 나왔습니다.
Standard Protein에 포함된 12kDa의 Thioredoxin과 29KDa의 Carbonic Anhydrase의 MS1 Peaks 모양입니다.
EThcD Fragmentation
Orbitrap Eclipse에 포함되어 있는 Top-down 분석용 Method에서 EThcD를 사용한후 DB 검색을 해보았습니다. MS2 parameters는 아래와 같습니다.
Proteome Discoverer 3.1 and ProSight 4.3
아래와 같이 단백질이 제대로 검출이 되었습니다. 제 인생의 첫 Top-down 분석입니다.
ProSight 에 포함된 Viewer를 통해 아래와 같이 Sequencing map도 볼수 있습니다.
앞으로 이미 알고 있는 몇개의 단백질에 대한 분석은 가능할듯합니다.
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