펩타이드 정제를 위한 C18 컬럼 선택

단백질을 효소 처리하여 펩타이드로 만든 후, 질량분석기로 분석하기 전에는 시료를 반드시 정제해야 합니다. 단백질 추출, 환원·알킬화, 효소처리 과정에서는 salt, detergent, buffer 성분, 효소, 환원제, 알킬화 시약 등 다양한 불순물이 시료에 포함될 수 있습니다. 이러한 성분들은 LC-MS/MS 분석에서 펩타이드의 이온화를 방해하거나, 나노 LC 컬럼과 질량분석기 성능에 부정적인 영향을 줄 수 있습니다. 따라서 가능하면 불순물은 제거하고 펩타이드만을 효율적으로 회수하는 것이 중요합니다.

 

프로테오믹스 시료 전처리에서 가장 널리 사용되는 방법 중 하나가 C18 컬럼을 이용한 peptide desalting입니다. 여기서 말하는 C18 컬럼은 HPLC 분석용 analytical column이 아니라, 펩타이드 정제를 위해 사용하는 작은 stage tip, spin column, cartridge 형태의 정제용 C18 컬럼을 의미합니다. 시료의 양에 따라 아주 작은 용량의 stage tip부터 상대적으로 큰 용량의 cartridge까지 다양한 형태의 C18 제품을 사용할 수 있습니다.

 

C18은 펩타이드와 소수성 상호작용을 통해 효율적으로 결합합니다. 반면 salt, 일부 detergent, buffer 성분과 같은 불순물은 C18에 잘 결합하지 않거나 washing 단계에서 제거됩니다. 이후 펩타이드는 acetonitrile과 같은 유기용매를 포함한 용리 버퍼로 회수할 수 있습니다. Acetonitrile은 질량분석에 비교적 적합하고, 용리 후 쉽게 건조할 수 있어 LC-MS/MS 분석 전 시료 준비에 매우 유리합니다. 이런 이유로 C18 정제는 효율성, 재현성, 질량분석 적합성을 모두 고려했을 때 가장 신뢰할 수 있는 전처리 방법 중 하나입니다.

 

C18 컬럼을 선택할 때 가장 중요한 기준은 제품의 종류보다 정제할 펩타이드 양에 맞는 적절한 컬럼 용량을 선택하는 것입니다. 회사마다 C18 resin의 입자 크기, pore size, 결합 용량, 제품 형태가 조금씩 다를 수 있지만, 최근에 판매되는 대부분의 정제용 C18 제품은 기본적인 desalting 효율이 좋은 편입니다. 따라서 실제 실험에서는 어떤 회사의 제품인지보다, 현재 시료량에 비해 컬럼이 너무 크거나 너무 작지 않은지가 더 중요합니다.

 

컬럼의 용량보다 많은 양의 펩타이드를 로딩하면 C18에 결합할 수 있는 양을 초과하게 됩니다. 이 경우 일부 펩타이드는 컬럼에 결합하지 못하고 flow-through 또는 washing fraction으로 빠져나가게 됩니다. 결국 펩타이드 손실이 발생하고, 분석 결과의 재현성도 떨어질 수 있습니다.

반대로 아주 적은 양의 펩타이드를 너무 큰 C18 컬럼으로 정제하는 것도 좋지 않습니다. 큰 컬럼은 resin의 양이 많고 표면적이 넓기 때문에, 펩타이드가 비특이적으로 결합할 수 있는 부위도 많아집니다. 특히 새 C18 컬럼이나 새 나노 LC 컬럼에는 펩타이드가 강하게 붙는 비특이적 결합 부위가 존재할 수 있습니다. 이러한 부위에 결합한 일부 펩타이드는 높은 농도의 유기용매를 사용하더라도 완전히 용리되지 않을 수 있습니다. 실제로 새 나노 컬럼을 장착한 후 QC peptide를 처음 주입했을 때 첫 번째 분석에서는 피크가 약하게 나오거나 거의 보이지 않는 경우가 있는데, 이것도 비슷한 현상으로 이해할 수 있습니다.

 

이러한 비특이적 결합 부위는 컬럼의 크기가 클수록 증가할 가능성이 있습니다. 따라서 매우 적은 양의 시료를 큰 용량의 C18 컬럼으로 정제하면 전체 시료량에 비해 손실되는 비율이 커질 수 있습니다. 반대로 많은 양의 시료를 너무 작은 C18 컬럼으로 정제하면 컬럼 용량을 초과해 일부 펩타이드가 결합하지 못하고 손실됩니다. 결국 C18 컬럼 선택의 핵심은 시료량과 컬럼 용량 사이의 균형입니다.

 

그렇다면 적절한 시료량과 컬럼 크기는 어떻게 판단할 수 있을까요? 우선 업체에서 제공하는 권장 용량을 참고하는 것이 좋습니다. 그러나 이 수치를 절대적인 기준으로 받아들이기는 어렵습니다. 업체가 제품의 결합 용량을 테스트할 때 사용한 시료가 실제 실험실에서 사용하는 시료와 다를 수 있기 때문입니다. 예를 들어 BSA 한 가지 단백질을 digestion한 10 µg 시료와 HeLa cell digest 10 µg 시료는 펩타이드의 복잡도, 소수성, 길이, 전하 상태가 모두 다릅니다. 따라서 같은 양의 peptide digest라고 하더라도 C18 컬럼에서의 결합 양상은 달라질 수 있습니다.

 

또한 용량을 표시할 때 기준이 되는 “시료량”이 무엇인지도 중요합니다. 실제로 peptide 양을 측정한 후 로딩한 것인지, 아니면 효소처리 전 단백질 양을 기준으로 계산한 것인지에 따라 해석이 달라질 수 있습니다. 단백질 digestion 효율, peptide recovery, 시료의 복잡도에 따라 실제 C18에 로딩되는 peptide 양은 달라질 수 있기 때문입니다. 따라서 업체에서 제공하는 결합 용량은 참고 자료로 사용하되, 본인의 시료에 그대로 적용된다고 생각해서는 안 됩니다.

 

새로운 C18 컬럼이나 새로운 제품을 사용하려고 한다면, 본인의 실험실에서 사용하는 대표 시료로 한 번 정도 테스트해보는 것이 좋습니다. 가장 간단한 방법은 알고 있는 양의 peptide digest를 C18 컬럼으로 정제한 후, 정제 전 시료와 정제 후 시료를 동일한 조건으로 준비하여 LC-MS/MS로 비교하는 것입니다. 이때 검출되는 peptide 수, protein group 수, chromatogram의 전체 intensity, peak shape, 재현성 등을 비교할 수 있습니다.

또 다른 방법은 C18 컬럼에 시료를 로딩한 후 flow-through fraction과 washing fraction을 따로 모아 건조한 뒤 LC-MS/MS로 분석하는 것입니다. 만약 flow-through 또는 washing fraction에서 상당한 양의 펩타이드가 검출된다면, 해당 조건에서는 컬럼의 결합 용량을 초과했거나 컬럼의 결합 효율이 충분하지 않다는 의미일 수 있습니다. 이 경우 더 큰 용량의 C18 컬럼을 사용하거나, 시료를 나누어 여러 번 정제하는 방법을 고려해야 합니다.

 

실험실에서는 보통 한 번 선택한 C18 제품을 장기간 계속 사용하는 경우가 많습니다. 따라서 새로운 제품을 도입하기 전에는 기존에 사용하던 제품과 비교 테스트를 해보는 것이 좋습니다. 단순히 업체에서 제공하는 스펙이나 권장 용량만 보고 결정하기보다는, 실제 본인의 시료에서 peptide recovery와 LC-MS/MS 결과가 얼마나 안정적으로 나오는지 확인하는 것이 더 중요합니다.

 예전에 한 업체에서 C18 컬럼을 무료로 제공하여 테스트해 본 적이 있습니다. 기존에 사용하던 컬럼과 동일한 시료를 이용해 비교했을 때, 새 제품에서는 flow-through에서 더 많은 펩타이드가 검출되고 최종 LC-MS/MS 결과도 좋지 않았습니다. 결국 해당 컬럼은 제 시료 조건에서는 효율이 낮다고 판단했고, 그 결과를 업체에 전달한 적이 있습니다. 이처럼 제품의 성능은 시료의 종류와 실험 조건에 따라 다르게 나타날 수 있습니다.

 

결론적으로 C18 정제에서 중요한 것은 단순히 좋은 제품을 선택하는 것이 아니라, 본인의 시료량과 시료 특성에 맞는 적절한 C18 컬럼을 선택하는 것입니다. 소량 시료에는 불필요하게 큰 컬럼을 피하여 비특이적 손실을 줄이고, 많은 양의 시료에는 충분한 결합 용량을 가진 컬럼을 사용하여 flow-through 손실을 방지해야 합니다. 특히 low-input sample, clinical sample, single-cell proteomics와 같이 시료량이 제한적인 경우에는 C18 컬럼의 크기와 용량 선택이 전체 분석 감도와 재현성에 큰 영향을 줄 수 있습니다.

 

여러분의 시료는 C18 정제 과정에서 안전하게 회수되고 있습니까? 한 번쯤은 flow-through와 washing fraction을 확인해보는 것이 좋습니다. 생각보다 많은 펩타이드가 컬럼을 그냥 지나가고 있을지도 모릅니다.