C18 컬럼을 이용한 펩타이드 정제

C18 컬럼을 이용한 펩타이드 정제는 proteomics 실험에서 빠져서는 안 되는 과정입니다. 방법 자체는 간단하지만, 처음 사용하는 사람에게는 각 용액을 어떤 순서로 넣어야 하는지, 얼마나 사용해야 하는지 헷갈릴 수 있습니다. C18 tip, spin column, cartridge 등 제품의 크기와 모양은 다양하지만 정제 원리는 거의 같습니다. 따라서 기본 원리를 이해하면 서로 다른 형태의 C18 제품을 사용하더라도 쉽게 적응할 수 있습니다.

 

 

단백질을 효소로 분해한 시료에는 펩타이드뿐 아니라 염, buffer, 계면활성제, 환원제 및 알킬화 시약 등이 남아 있습니다. 이러한 물질은 LC–MS 분석을 방해하고 nano-LC 컬럼이나 질량분석기를 오염시킬 수 있습니다. C18 정제는 펩타이드는 resin에 결합시키고, 염과 친수성 오염물질은 씻어낸 다음, 마지막에 펩타이드만 회수하는 과정입니다.

C18 resin의 표면에는 긴 탄화수소 사슬이 결합되어 있어 소수성(hydrophobic) 성질을 가집니다. 펩타이드는 산성 수용액 조건에서 C18에 결합하지만, acetonitrile(ACN)과 같은 유기용매의 농도가 높아지면 C18에서 떨어져 나옵니다. C18 정제는 이러한 성질을 이용합니다.

 

1. C18 resin conditioning

먼저 100% ACN을 컬럼에 통과시킵니다. 이 과정을 wetting 또는 activation이라고 합니다. 소수성인 C18 resin은 물만으로는 충분히 젖지 않기 때문에 ACN으로 resin 전체를 균일하게 적셔 주어야 합니다. C18은 소수성 물질이기 때문에 이곳에 붙어 있는 물질은 소수성이 높은 물질일수 있습니다. 그러므로 물로는 제거되지 않고 유기용매로 제거해야 합니다.

 

일반적으로 resin 부피의 약 3–5배에 해당하는 100% ACN을 사용합니다. Resin 부피의 몇 배에 해당하는 용액을 사용하는지는 column volume(CV)으로 표현합니다. 예를 들어 resin 부피가 100 µL라면 1 CV는 100 µL이고, 3 CV는 300 µL입니다.

2. 컬럼 평형화

다음으로 0.1% TFA 수용액을 통과시켜 컬럼을 산성 수용액 조건으로 바꾸어 줍니다. 이 과정을 equilibration 또는 conditioning이라고 합니다. 이 단계에서는 앞에서 사용한 ACN을 제거하고, 펩타이드가 C18에 잘 결합할 수 있는 낮은 pH와 낮은 유기용매 조건을 만듭니다.  일반적으로 resin 부피의 약 3–5배에 해당하는 0.1% TFA를 사용합니다. 

 

3. 시료 준비와 로딩

시료는 0.1% TFA와 같은 강한 산이 포함된 수용액에 녹입니다. 시료에 ACN이나 다른 유기용매가 많이 포함되어 있으면 펩타이드가 C18에 결합하지 못하고 그대로 통과할 수 있습니다. 일반적으로 ACN 농도는 5% 이하로 유지하고, pH는 약 2–3이 되도록 준비하는 것이 좋습니다.  시료를 컬럼에 천천히 통과시키면 펩타이드는 C18에 결합하고, 많은 염과 친수성 물질은 그대로 빠져나갑니다. 시료를 너무 빠르게 통과시키거나 C18의 결합 용량보다 많은 펩타이드를 넣으면 손실이 증가할 수 있습니다.

Spin column을 사용하는 경우에는 적절한 원심분리 속도를 선택해야 합니다. 기본적으로 제조사의 manual에 제시된 원심분리 속도와 시간을 따르는 것이 가장 좋습니다. 다만 용액이 컬럼을 지나치게 빠르게 통과한다면 원심분리 속도를 조금 낮추는 것을 고려할 수 있습니다. 특히 시료 로딩 단계에서는 펩타이드와 C18 resin이 접촉하여 결합할 시간이 필요합니다. 반대로 속도가 너무 낮아 용액이 resin에 남아 있어도 실험의 재현성이 떨어질 수 있으므로, 용액이 일정한 속도로 통과하도록 조건을 맞추는 것이 중요합니다.

4. 컬럼 세척

시료를 넣은 다음에는 산성인 0.1% TFA 또는 0.1% F.A. 수용액으로 컬럼을 세척합니다. 펩타이드는 C18에 결합한 상태로 남아 있고, 염과 친수성 오염물질은 제거됩니다.

충분한 세척을 위해 일반적으로 resin 부피의 약 5–10배에 해당하는 용액을 사용합니다. 예를 들어 resin 부피가 100 µL라면 약 500–1,000 µL의 세척용액을 사용하는 것입니다. 염이 많지 않은 일반적인 시료는 약 5 CV로 충분할 수 있지만, 염 농도가 높은 시료는 10 CV에 가깝게 세척할 수 있습니다. 필요하면 2–5% ACN이 포함된 0.1% TFA를 세척용액으로 사용할 수도 있습니다. 소량의 ACN은 약하게 결합한 오염물질을 제거하는 데 도움이 됩니다. 그러나 ACN 농도가 너무 높으면 친수성이 강한 펩타이드도 함께 빠져나갈 수 있습니다.

5. 펩타이드 용리

세척이 끝나면 ACN 농도를 높여 펩타이드를 용리합니다. 일반적으로 50–80% ACN에 0.1% formic acid가 포함된 용액을 사용합니다. 많은 펩타이드는 50–60% ACN에서도 용리되지만, 소수성이 높은 펩타이드까지 회수하려면 70–80% ACN이 필요할 수 있습니다. 일반적인 proteomics 시료에서는 약 60–70% ACN을 사용하는 것이 무난합니다.

용리용액은 resin 부피의 약 1–2배부터 시작하는 것이 좋습니다. 한 번에 많은 양을 사용하는 것보다 1 CV씩 두 번 용리하여 같은 튜브에 받으면 적은 부피로 회수율을 높일 수 있습니다.

 

제품의 형태와 dead volume에 따라 resin 전체를 적시는 데 필요한 용액의 양이 달라질 수 있으므로, 실제 사용량은 제조사의 권장 조건을 먼저 확인해야 합니다.

 

용리용액을 너무 많이 사용하면 펩타이드가 지나치게 희석되고 SpeedVac 건조 시간도 길어집니다. 특히 펩타이드 양이 적은 시료는 튜브 표면에 흡착되거나 건조 후 완전히 재용해되지 않아 손실될 수 있습니다. 따라서 resin 전체를 충분히 적실 수 있는 범위에서 가능한 한 적은 부피로 용리하는 것이 좋습니다.

 

또한 100% ACN으로 펩타이드를 용리할 필요는 없습니다. ACN 농도가 지나치게 높으면 펩타이드뿐 아니라 C18에 강하게 결합한 지질과 소수성 오염물질까지 함께 용리될 수 있습니다. 따라서 대부분의 펩타이드를 회수할 수 있는 정도의 ACN 농도를 선택하는 것이 좋습니다.

 

펩타이드의 결합과 세척에는 TFA가 효과적이지만, 최종 용리에는 formic acid가 더 적합합니다. TFA가 최종 시료에 많이 남으면 electrospray ionization을 억제하고, 건조 후 재용해한 시료를 지나치게 강한 산성으로 만들 수 있습니다. Formic acid는 TFA보다 휘발성이 높고 질량분석에 미치는 영향이 적습니다.

 

용리된 펩타이드는 SpeedVac으로 건조한 후 0.1% TFA 수용액에 다시 녹입니다. 펩타이드가 잘 녹지 않으면 2–5% ACN을 첨가할 수 있습니다. 다만 ACN 농도가 너무 높으면 LC 주입 후 trap column이나 analytical column에서 펩타이드의 결합과 peak focusing이 저하될 수 있으므로 주의해야 합니다.

 

C18 컬럼으로 펩타이드가 정제되는 원리를 알고 있으면 다양한 제품에 대해서도 쉽게 익숙해질 수 있습니다.