S-Trap은 어떻게 SDS를 제거할까?

SDS buffer를 사용하면 단백질을 효과적으로 추출하고 변성시킬 수 있지만, SDS가 남아 있으면 이후의 trypsin digestion이나 LC-MS 분석에 방해가 될 수 있습니다. S-Trap은 이러한 SDS를 제거하면서 단백질은 잃지 않도록 설계된 시료 전처리 방법입니다.

S-Trap에서 가장 중요한 원리는 단백질과 SDS의 성질을 서로 다르게 만들어 분리하는 것입니다.

 

 

먼저 SDS가 포함된 단백질 시료에 phosphoric acid를 첨가하여 시료를 산성화합니다. 그다음 높은 농도의 methanol이 포함된 S-Trap binding buffer를 첨가합니다.

 

 

이 조건에서는 단백질의 용해도가 크게 감소하여 단백질이 미세하게 침전됩니다. 반면 SDS는 methanol이 포함된 용액 속에 남아 있을 수 있습니다.이 상태의 시료를 S-Trap column에 넣으면 침전된 단백질 입자는 column 내부의 filter matrix에 붙잡히게 됩니다. 반면 SDS를 포함한 용액 성분은 원심분리 과정에서 filter를 통과하여 밖으로 빠져나갑니다.

 

S-Trap의 filter matrix를 조금 더 정확하게 설명하면, 일반적인 membrane filter와는 상당히 다른 구조입니다. S-Trap의 초기 연구에서 사용된 matrix는 quartz depth filter, 즉 석영(quartz, 주성분 SiO₂)으로 이루어진 3차원 다공성 필터입니다. 연구진은 이 quartz filter를 선택한 이유 중 하나로 digestion 조건에서 peptide의 비특이적 결합이 낮다는 점을 제시했습니다. Quartz의 표면은 silica이기 때문에 화학적으로 변형될 수도 있습니다.

 

단백질은 acid와 methanol 조건에서 미세한 입자가 되어 filter matrix에 포획됩니다. 하지만 SDS와 salt를 비롯한 작은 오염물질은 단백질 입자처럼 matrix에 포획되지 않고 용액과 함께 통과할 수 있습니다.

 

 

따라서 S-Trap에서는 다음과 같은 분리가 일어납니다.

Protein → 침전된 상태로 S-Trap filter에 포획

SDS → 용액에 남아 filter를 통과 → washing 과정에서 제거

SDS를 충분히 제거한 후에는 S-Trap 내부에 남아 있는 단백질에 trypsin과 같은 protease를 직접 첨가하여 digestion을 진행할 수 있습니다. 단백질이 peptide로 분해되면 생성된 peptide는 다시 용해되며, 이후 S-Trap에서 회수하여 LC-MS 분석에 사용할 수 있습니다.

S-Trap의 전체 과정을 간단히 정리하면 다음과 같습니다.

SDS를 이용한 단백질 추출
→ 산 첨가
→ 고농도 methanol 첨가
→ 단백질 침전
→ S-Trap filter에 단백질 포획
→ SDS와 기타 불순물 세척 제거
→ filter 위에서 단백질 digestion
→ peptide 회수

 

여기서 중요한 점은 S-Trap이 SDS를 C18처럼 소수성 상호작용을 이용하여 제거하는 것이 아니라는 것입니다. 단백질을 먼저 침전시켜 고정한 뒤, SDS가 포함된 용액을 씻어내는 방식으로 SDS를 제거합니다.

따라서 SDS를 사용하여 단백질을 추출해야 하는 proteomics 실험에서 S-Trap은 SDS 제거와 단백질 digestion을 연속적으로 수행할 수 있는 유용한 방법입니다