SDS는 왜 C18 컬럼에서 잘 제거되지 않을까?

C18 컬럼은 펩타이드 시료에서 염(salt)이나 친수성 불순물을 제거하는 데 매우 유용합니다. 하지만 SDS(sodium dodecyl sulfate)와 같은 계면활성제는 일반적인 C18 정제만으로 충분히 제거하기 어렵습니다. 그 이유는 SDS의 구조와 C18 컬럼의 성질을 살펴보면 쉽게 이해할 수 있기 때문입니다.

 

 

SDS는 한쪽에 물과 잘 섞이는 sulfate group을 가지고 있고, 다른 한쪽에는 12개의 탄소로 이루어진 긴 탄화수소 사슬을 가지고 있습니다. 즉, 하나의 분자 안에 친수성 부분과 소수성 부분을 동시에 가지고 있는 계면활성제입니다.

C18 컬럼의 표면 역시 긴 탄화수소 사슬로 이루어져 있어 소수성 물질과 잘 결합합니다. 펩타이드를 C18 컬럼에 넣으면 펩타이드의 소수성 부분이 C18과 상호작용하여 컬럼에 머무르게 됩니다. SDS도 긴 소수성 탄화수소 사슬을 가지고 있기 때문에 C18과 강하게 상호작용할 수 있습니다.

 

이 점이 salt와 SDS의 중요한 차이입니다.

일반적인 salt는 C18과 거의 결합하지 않습니다. 따라서 펩타이드를 C18에 결합시킨 후 물이나 낮은 농도의 유기용매로 세척하면 salt는 쉽게 빠져나갑니다. 이것이 C18 정제를 흔히 desalting이라고 부르는 이유입니다.

 

반면 SDS는 소수성 부분 때문에 C18에 머무를 수 있습니다. 따라서 세척 과정에서 완전히 제거되지 않을 수 있으며, 이후 acetonitrile(ACN) 농도를 높여 펩타이드를 용출할 때 SDS도 함께 용출될 수 있습니다. 결국 C18 정제를 했음에도 최종 펩타이드 시료에 SDS가 남을 가능성이 있습니다.

 

이를 간단히 비교하면 다음과 같습니다.

Salt → C18에 거의 결합하지 않음 → 세척 과정에서 제거

Peptide → C18에 결합 → 높은 농도의 유기용매로 용출

SDS → C18에 결합할 수 있음 → 펩타이드와 함께 용출될 가능성

이러한 이유로 C18 컬럼은 salt 제거에는 매우 효과적이지만, SDS 제거를 목적으로 사용하는 방법은 아닙니다.

 

특히 LC-MS 분석에서는 소량의 SDS도 문제가 될 수 있습니다. 남아 있는 SDS는 electrospray ionization(ESI) 과정에서 펩타이드의 이온화를 방해하여 신호를 감소시킬 수 있고, LC column이나 질량분석기를 오염시킬 수도 있습니다. 따라서 SDS를 사용하여 단백질을 추출한 경우에는 펩타이드를 C18으로 정제하기 전에 SDS를 충분히 제거하는 과정이 필요합니다. 이를 위해 protein precipitation, FASP, S-Trap, SP3와 같은 시료 전처리 방법이 사용될 수 있습니다.