Commercial Target protein 구매를 통한 PRM 분석 최적화

상대적인 정량분석을 통해 얻은 결과중에 흥미로운 단백질이 발견되면 그 특정 단백질만을 이용하여 다시 정량분석을 하게 됩니다. 이때 보통 PRM과 같은 Targeted assay를 합니다.  다음단계로 가기 위해서는 보통 standard synthetic peptides가 필요할 경우가 많습니다.  검출된 단백질에 해당하는 펩타이드중에 가장 좋은 펩타이드를 몇개 골라서 합성을 의뢰합니다.  조금더 최적화를 위해서 저렴한 순도가 낮은 light 펩타이드를 먼저 합성하여 실험을 하는 경우도 있습니다.  또한 이미 발견된 펩타이드가 있기 때문에 보통 heavy isotope 펩타이드를 의뢰합니다. 

 

하지만 해당 단백질를  업체를 통해 저렴하게 구할수 있으면 단백질 자체를 구매하는것이 여러모로 좋을때가 있습니다.  단백질 자체를 구매할 경우 tryptic digestion을 수행해야하는 번거로움이 있습니다.  하지만 단일 단백질을 사용하기 때문에 보다 많은 펩타이드를 검출할수 있습니다. 또한 해당 단백질에 존재하는 여러 다른 펩타이드들의 상대적인 intensity나  tryptic digestion efficiency 등도 비교할수 있습니다. 

 

업체에서는 여러가지 형태로 (recombination or purification)  판매를 합니다.  상대적으로 회수가 쉬운 단백질은 저렴합니다. 그래서 여러개의 펩타이드에 대해 합성을 의뢰하는것보다 저렴할때가 있습니다.

 

예를 들어 이전에 실험한것중에 Vitronectin 단백질이 있습니다. 이 단백질을 Sigma aldrich에서 구매하면  50ug에 약 350불정도가 됩니다. 보통 한개의 펩타이드 합성가격이지만 이 가격으로 여러 펩타이드를 분석할수 있습니다. 물론 이 단백질은 순도가 낮기 때문에 펩타이드 한개를 합성해서 사용하는것과는 다릅니다. 하지만 초기 분석조건을 최적화 하는데는 아무런 문제가 없습니다. 

 

Tryptic digestion후 100ng으로 분석한 크로마토그램입니다. 

 

이것을 Proteome Discoverer로 검색을 하면 아래와 같은 단백질이 검출됩니다. Vitronectin이외에 많은 혈액 단백질이 검출이 되었습니다.   구매한 vitronectin은 human 혈액에서 회수한것이라 다른 혈액 단백질도 많이 검출이 됩니다. 아마 순순하게 vitronection만을 회수가 어렵기 때문입니다. 하지만 PRM 최적화 하는데는 큰 문제가 없습니다.

 

 

PRM 분석을 위한 펩타이드 리스트를 만들기 위해서 DDA에서 검출된 펩타이드를 사용하거나 혹은 Skyline에서 vitronectin fasta를 import하여 이론적인 펩타이드를 모두 선정할수 있습니다.  

 

 

아래는 Skyline에서  Vitronectin의 fasta file을 이용하여 만들어진 펩타이드 리스트입니다.

이를 이용하여 unscheduled PRM을 수행합니다. 그리고 이중에서 잘 검출된 펩타이드를 선정합니다. 아래는 선정된 펩타이드리스트입니다. 총 10개의 펩타이드를 선정하였습니다. 

 

 

이 펩타이드를 이용하여 다시 scheduled PRM을 수행하여 제대로 검출이 되는지 확인을 합니다. 아래는 Schedule PRM을 이용하여 3번 반복한후 얻어진 skyline 결과입니다.  여러개의 펩타이드가 검출되었습니다. 각 펩타이드의 intensity는 상당히 다르다는것을 알 수 있습니다. 즉 이중에 가장 Intensity가 좋은것을 우선적으로 정하면 됩니다.

 

 

 

Scheduled PRM에 아무런 이상이 없을 경우 이 method를 이용하여 실제 시료에 적용하면 됩니다.