150 µm ID (내경) 컬럼의 nano column으로 낮은 압력으로 펩타이드 분리하기

Nano LC를 이용한 펩타이드 분석에서 분리능을 향상시키기 위해서 최대한 사이즈를 줄이고 있습니다. LC 의 성능이 좋아져서 고압력에서도 운영이 가능하기 때문에 C18 material의 사이즈도 5 µm에서  1.9µm로 줄어들었습니다.

또한 Column ID (내경)의 크기도 줄어듭니다. 보통 75 µm ID를 사용하지만 종종 50 µm 도 사용합니다.  이렇게 하여 피크의 분리능을 향상시키면 좋을듯합니다. 하지만 사이즈가 작아짐에 따라 Troubleshooting을 할 경우도 증가됩니다. 얻는 만큼 잃는것도 있습니다.

 

 

가끔씩은 마음이 편한 상태로 실험을 하고 싶을 때가 있습니다. 내경이 큰 컬럼을 사용할 경우 시스템의 압력도 줄어들고 flow-rate도 상대적으로 많이 증가시킬수 있어서 여러모로 편할수가 있습니다.  Flow-rate이 증가되면 상대적으로 LC retention time의 재현성이 증가됩니다. 또한 컬럼의 내경이 증가됨에 시료의 loading capacity도 증가됩니다. 

 

그래서 150 µm ID의 fused silica tubing을 이용하여  Laser puller 로 컬럼을 만들었습니다. 전체길이는  30 cm에  2.4 µm C18을 충전하였습니다.  컬럼의 내경이 커서 그런지 C18의 충전도 상대적으로 잘되었습니다.

 

Easy nLC setting for 150 µm ID column

Easy nLC에서 one-column step (no-trap column)을 사용하여 trap-column없이 analytical column에 시료가 바로 loading되도록 하였습니다.  Sample Loading 과 Analytical column equilibrium에서  압력을 600 bar로 설정하였습니다.

 

 

압력이 600 bar 일때 flow-rate이 1.5 µL/min정도가 되어 모든 과정이 빨리 진행됩니다. 즉 4 µL를 흘려주는데 3분이 채 안걸립니다.

 

LC gradient 조건은 아래와 같습니다. 분석시 사용할 Flow-rate는  700 nL/min 로 설정하였습니다.  컬럼의 내경이 크고 길이가 30cm 컬럼이라서 상대적으로 기울기가 큰 gradient를 사용하였습니다.  

 

Easy nLC, LC gradient condition for 150 µm ID column

700 nL/min의 유속에서 약 240 bar 정도의 압력이 됩니다. 

 

 

Chromatogram of BSA and Yeast digests using 150 µm ID column

아래는 60min gradinent에서 보여준 100fmol BSA와 100ng Yeast digest에 대한 크로마토그램입니다.

아주 좋은 재현성을 보여줍니다. 또한 피크의 분리능도 나쁘지 않습니다.

 

Base-Peak Chromatogram of 100fmol BSA, 150 µm ID, 2.4 µm C18, 30 cm length

 

Base-Peak Chromatogram of 100ng Yeast digests, 150 µm ID, 2.4 µ C18, 30 cm length

 

큰 내경의 컬럼의 장점

빠른 유속상태에서 낮은 압력에서 이정도의 재현성과 분리능을 가질수 있으면 나쁘지 않다고 생각합니다.

만약 PRM분석의 경우 원하는 target peptide가 matrix에 비해서 아주 극소량으로 존재할때, target peptide의 검출기회를 높이기 위해서 전체시료의 주입량을 증가시켜야 할때가 있습니다.  하지만 컬럼의 capacity의 제한으로 일정량 이상으로 시킬수가 없을때가 있습니다.  증가시키더라도 오히려 시료의 손실이 생기거나, 피크의 분리능이 현저히 떨어지거나, 아니면 컬럼이 막혀서 실험이 실패될수가 있습니다. 150 µm 내경의 컬럼의 경우 피크의 분리능이  75 µm 내경의 컬럼과 유사하다면 위에서 말한 단점을 해소할수 있습니다.

 

 

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