긴 컬럼을 사용할때의 고려해야 될 점

 

논문에서 보면 긴 컬럼을 사용하여 많은 단백질을 검출하거나 혹은 아주 극미량 단백질을 검출한 방법이 소개됩니다. 사실 이런 논문을 보면 직접 적용해보고 싶은 마음이 들곤합니다.

 

하지만 아주 긴 컬럼을 사용하는것이 꺼려지는 이유중 하나는 높은 압력으로 인해 시스템에 무리가 많이 가기 때문입니다. 과연 일반실험실에서 논문에 나온방법을 이용하여 매일 사용할수 있을지 의문입니다. 또한 논문에 나온 실험실로 과연 매일 사용하는지 아니면 논문을 발표한후 더 이상 사용하지 않는지도 모릅니다.

 

가끔씩 50 cm 컬럼을 사용해볼때가 있습니다.  하지만 압력도 문제이지만 좋은 Gradient  조건을 찾는것이 쉽지 않습니다. 특히 Void volume이 상대적으로 크기 때문에 첫 펩타이드 피크가 나오는데 상당한 시간이 걸립니다.  그래서 보통 짧은 컬럼을 사용할때보다 높은 Buffer B  조건으로 시작합니다. 아니면 낮은 Buffer B(1~3% B)로 시작하고 바로 7~10% B로 증가시키는 경우도 있습니다.  하지만 빨리 용리되도록 조건을 최적화 하면 차후에 모든 펩타이들이 일찍 용리되서 뒤쪽에서  불필요한 시간이 소요됩니다.

 

 

아래는 상대적으로 짧은 컬럼을 사용했을때의 크로마토그래프입니다.  60min gradient 에서 펩타이드들이 거의 55분에 걸쳐서 용리되었습니다.  

 

 

아래는 50cm 컬럼에 대한 크로마토그래프입니다. 어느정도 최적화하였지만 첫 피크들이 10분에서 용리되기 시작합니다.  물론 50cm 컬럼임으로 피크의 분해능이 더 좋아져서 더 많은 단백질이 검출될수 있습니다.  그런데  크로마토그래피를 전공해서그런지 피크들이 골로루 퍼져 있지 않으면 아주 불편합니다. 왠지 더 넓게 퍼지게 만들어야 될것 같은 마음이 듭니다.  직업병이겠지요

 

 

최근에 나온 논문중에 20 um i.d, 50cm 컬럼으로 single cell을 분석한 논문을 보았습니다.  컬럼 특성상 낮은 flow-rate (20nL/min)를  사용하였습니다.   아주 긴 컬럼을 이용하여 Single-cell 분석을 한 논문에서 얻은 raw file을 다운받아서 확인해보았습니다.

 

Ultrasensitive single-cell proteomics workflow identifies >1000 protein groups per mammalian cell (nih.gov)

 

예상한대로  Void time이 상당히 큽니다. 170 min의 LC gradient중 실제로 펩타이드가 분석되는 부분은 1/3정도 밖에 되지 않습니다.  HPLC 관점에서 보면 상당히 비효율적인듯 합니다. 하지만  더 좋은 데이타가 나올수 있다면 시간적인 비효율성은 감수할수 있을듯 합니다.

 

 

회사에서 제공하는 크로마토그램을 자세히 보면 크로마토그램의 전체를 보여주는것이 아니라 펩타이드가 나오는 부분만 보여주는 경우도 있습니다. 또한 뒤쪽에서 얼마만큼 Void 시간이 있는지 알수 없습니다.