6분만에 단백질 분석하기 (커피한잔하고 와서 결과보기)

분석시간이나 장비시간에 특별히 제한이 없을 경우 간단한 단백질을  분석할때도 기존에 사용하던 긴 LC time 방법을 그냥 사용합니다.  하지만  분석결과에 큰 영향을 주지 않는 선에는 최대한 짧은 시간에 분석을 끝낼수 있다면 주어진 시간에 더 많은 시료를 분석할수 있습니다.

 

이전에도 글을 올린적이 있습니다.

짧은 LC gradient로 단일단백질 검출하기

 

이번에는 EasySpray컬럼이 연결된 Vanquish Neo 와 Orbitrap Eclipse를 사용해서 더 짧은 시간에 검출을 해보았습니다

짧은 EasySpray컬럼의 장점을 잘 활용하면 간단한 단백질을 빠른시간내에서 감도의 큰 감소없이 분석할수 있습니다. 시료수가 매우 많을 경우 더 효율적일수 있습니다. 15cm길이의  EasySpray컬럼은 길이가 짧고 또한 heating이 가능하기 때문에 상대적은 높은 flow-rate에서  분석이 가능합니다. 또한 2 µm C18이기 때문에 분리능도 좋습니다.

 

보통 IP 등으로 정제된 단백질의 경우 긴 분석시간이 필요하지 않습니다.   3가지의 단백질 (BSA, Enolase, Alcohol Dehydrase)를 각각 tryptic digestion 한후 100ng을 60분, 15분, 10분, 6분으로 분석하였습니다. 아래는 각각의 크로마토그램입니다.

 

• BSA(Pierce, 23209, 2mg/mL)
• Enolase (SigmaAlrich, E6126-500UN)
• Alcohol Dehydrogenase (SigmaAldrich, A8656-1VL) 

 

6, 10, 15, 60min Chromatograms

100ng BSA with different LC gradients

 

 

100ng enolase with different LC gradients

 

100ng Alcohol Dehydrogenase with different LC gradients

 

6 min LC gradient method

 

아래는  LC gradient 와 MS/MS에 대한 parameter 입니다. 짧은 Gradient를  사용할 경우 주어진 시간에 상대적으로 많은 펩타이드들이 용리됩니다. 하지만 정제된 단백질의 경우 펩타이드의 수가 많지 않습니다. 최근 질량분석기의 속도로 충분히 검출이 가능합니다. 특히 Orbitrap Eclipse의 Iontrap의 Tubo mode를 잘 활용하면 도움이 될수 있습니다. 일반적인 정성분석에서는 Turbo scan을 사용할 경우 감도가 줄어들수 있습니다. 그러나   잘 정제된 단백질의 경우 상대적으로 적은 수의 펩타이드가 높은 감도로 검출되기 때문에 Turbo scan과 같은 빠른속도에서 큰 영향이 없습니다. 또한 짧은 Gradient로 인해 Peak가 더 좁아지는 효과가 있습니다.  이는 더 좋은 MS/MS 스펙트럼을 얻는데 도움이 됩니다.  또한 Exclusion time을 조금 낮은 값으로 설정합니다. 좁은 피크에서 최소 1~2번의 MS/MS를 수행할수 있도록 합니다. 

 

Sequece Coverage & Unique Peptide #

 

아래는 검색을 통해 얻어진 Sequence coverage와 Unique peptide 수입니다. 3개의 단백질에 해당하는 fasta로만 검색을 하였기 때문에 스펙트럼중에 false-positive가 있을수 있습니다. 단순히 비교만 해본다면 6min에서 얻어진 결과와 60min 결과가 큰 차이가 없는것 같습니다. 잘 정제된 단일 단백질이기 때문에 가능한것 같습니다.

 

 

 

커피한잔하고 오면 결과가 기다리고 있겠네요.