Trap column에서 Hydrophilic peptides가 손실되는 현상

Thermo 에서 판매되는 trap-column은 크게 두가지가 있습니다. 하나는 일체형으로써  한쪽만 막혀있어서 한 방향으로만 용매가 흘러야 됩니다. 그렇지 않으면 C18 materials이 뒤로 빠져나갈수 있습니다. 다른 하나는 Cartridge 형태로써 양쪽이 모두 막혀있습니다. 하지만 이것은  Cartridge holder가  필요하고 또한 양쪽을 연결할수 있는 짧은 viper tubing이 필요합니다. 이론적으로 봤을때는 추가적인 연결이 필요없는 첫번째것이 더 좋아 보입니다. 하지만 Cartridge holder와 tubing을 가지고 있다면 Trap column cartridge만 바꾸면 되는  두번째 형태가 가격적으로는 더 저렴합니다.

Vanquish Neo도 두개 모두 연결할수 있습니다.  하지만 설치를 할때는 특별히 주의를 해야 합니다. 첫번째 타입의 컬럼을 설치할 경우 아래와 같이 No를 설정해줘야 합니다.   

 

Neo의 안쪽은 공간이 좁아서 특히 cartridge 형태의 컬럼은 연결할때 다소 불편함이 있습니다. Sample loop를 덮고 있는 커버로 인해 공간이 좁고 이로 인해  tubing이 꺽이게 되는 경우가 있습니다. 처음에 부주의 하여 한개가 뿌러졌습니다.   아래는 일체형 Trap column이 장착된 사진입니다

 

 

 

 

이전의 테스트에서 보았듯이 Trap-colum을 사용할 경우 Direct injection에 비해서 경우에 따라 시료의 손실이 어느정도 있을수 있습니다.

 

Trap-column 상태확인하는 방법 (Checking efficiency of trap-columns)

Trap-column 상태확인하는 방법 (Checking efficiency of trap-columns)

 

특별히 hydrophilic한 펩타이드의 경우  loading 과정에서 잘 결합되지 않는 경우가 있습니다. 아래에서 보는것과 같이 Trap-column의 경우 hydrophilic 한 펩타이드의 Intensity가 줄어들었습니다. 하지만 다른 펩타이드의 경우 특별히 차이가 없거나 오히려 약간 증가 되었습니다. 왼쪽 그림의 화살표에서 보듯이 hydrophilic 한 펩타이드가 처음에 많이 용리됩니다. 하지만 trap-column mode에서 상대적으로 낮습니다.  이러한 펩타이드들이 trap-column에서 손실이 됩니다. Direct injection (no-trap) 컬럼에서는  이러한 펩타이드가 바로 긴 analytical column에 결합되기 때문에 빠져나가지 못합니다.

 

 

물론 조건에 따라 혹은 column lot에 따라 달라질수 있습니다.  그래서 시료를 녹일때 0.1% formic acid보다는 0.1% TFA로 녹이면 도움이 됩니다.  하지만 시료의 양이 많을 경우 처음부터 TFA에 녹여서 보관하지는 않습니다. 강한 산성조건에서 펩타이드가 오래 있는것이 좋지 않을듯합니다.  그래서 0.1% F.A.에 보관하였다가 필요한 만큼 덜어낸후 10% TFA를 소량 첨가하기도 합니다 (< 1uL). 전체 시료 volume에는 영향을 주지 않습니다.

 

보통 실험실에는 한가지 mode, 주로 trap-column  mode를 사용합니다.  그래서 자신이 사용하는 trap column에서  hydrophilic 한 펩타이드가 얼마나 손실이 되었는지 알지 못합니다.  하지만 여전히 trap-column을 사용하는것을 추천합니다. 약간의 손실이 있더라도 전체적으로 시스템의 오염을 많이 줄일수 있기 때문입니다. 질량분석기가 오염되는것이 더 큰 문제가 됩니다. 또한 Hydrophilic 한 펩타이드가 손실되더라도 전체적인 단백질 수에는 큰  영향을 주지 않을것입니다.

 

Formic acid(F.A) 와 trifluoroacetic acid (TFA)의 Trap-column에 대한 펩타이드 결합력 비교

Formic acid(F.A) 와 trifluoroacetic acid (TFA)의 Trap-column에 대한 펩타이드 결합력 비교