EasySpray column(75µm x 25cm, 2µm C18)의 180min gradient chromatogram

EasySpray column (75um x 25cm, 2um C18)에서 3시간 LC gradient에 적합한 조건을 찾아보았습니다. 개인적으로는  3시간 LC gradient를 그다지 좋아하지 않습니다.  단백질은 더 많이 찾을수 있겠지만 하루에 분석할수 있는 시료수가 많지 않습니다. 

• HPLC: Vanquish Neo
• Trap-column : Acclaim PepPap, 75µm x 20mm, 3µm, 100A
• Analytical Column: EasySpray 75µm x 25cm, 2µm C18
• Buffer A: 0.1% F.A. in H2O/ Buffer B: 80% ACN+20% F.A.
• Flow rate: 300nL/min
• Sample: 1µg K562

 

먼저 120 min LC gradient 조건에서 분리되는 영역에서 60min만 추가하였습니다.

 

 전반적으로 잘 나왔지만 전체적으로 앞쪽으로 치우쳐져 있습니다. 그리고  끝부분에서도 계속 펩타이드가 용리됩니다. 아마 180이후에도 펩타이드가 나올 가능성이 있습니다.  이 두가지를 고려하여 앞쪽에 용리되는 펩타이드를 약간 오른쪽으로 분산시키고 180min 이후에 나올수 있는 펩타이드를 조금 더 빨리 용리시키고자 합니다.

 

  아래와 같이 약간 변경하였습니다.

 

 

예상대로 크로마토그램이  나왔습니다. 뒤쪽에 큰 피크들은 2+ 이상의 전하를  가진것을 보아  펩타이드이들 가능성이 높고 또한 Hydrophobic한 펩타이드들이 몰려서 용리된것 같습니다.