C18 Spin-column 분획후 Oribtrap Eclipse로 10,000 단백질 검출하기

100 µg시료 (Human K562+Yeast)를  C18 Spin-column 이용하여 Orbitrap Eclispe에서 10,000개 단백질 검출하기

 

사전 분획(Pre-Fractionation)은 실험에 따라 반드시 필요한 단계입니다. HPLC장비를 이용하여 분획을 하면 좋겠지만 최근에서는 대부분은 Spin-column 을 이용하여 Small scale로 분획을 합니다.  고가의 HPLC 가 필요없음뿐더러 소량의 단백질만 있으면 됩니다.  높은 질량분석기의 감도로 인해 small scale의 분획으로도 충분히 많은 단백질을 검출할수 있습니다.

 

Thermo 사의 Pierce™ High pH Reversed-Phase Peptide Fractionation Kit (P/N 84868) 가 있긴 하지만 실험실에서 clean-up으로 사용하는 Harvard Appartus사의 컬럼을 사용합니다. 96개 팩을 사면 아주 오래 사용할수 있습니다. 보통 100 ug정도를 분획할때는 micro spin-column을 사용하고 50 µg이하일때는 ultra micro-spin column을 사용합니다. 

 

C18 Reversed Phase Chromatography SpinColumns (Harvard Apparatus)을 이용한 펩타이드 전처리

C18 Reverse Phase Chromatography SpinColumns (Harvard Apparatus)을 이용한 펩타이드 전처리

각 분획당300 x g속도로 1분이내면 충분합니다.  사실 C18 컬럼은 종종 재상용하기도 합니다.  Clean-up으로 사용한후  다시 Fractionation에 사용하기도 합니다. 굳이 고가의 Kit를 사용하지 않아도 될듯합니다.

 

Buffer Composition

사용하는 Buffer는 100 mM TEAB 와 100% Acetonitrile 적절한 비율로 혼합하여 사용합니다.

적절한 분획비율을 찾기 위해서 가능한 많은 분획을 한후 이중에 대표적인것을 고르면 될듯합니다. 실험후에 특별히 차이나지 않은 분획은 합치면 됩니다. 먼저 5, 7.5, 10, 12.5, 15, 17.5, 20, 22.5, 25, 30, 50, 70% 로 만들었습니다. 5%에서는  소수의 펩타이드만 검출되고 대략 50% 이하에서 대부분의  펩타이들이 용리될것이라 예상합니다. 

 

Samples

Promega사의 Human (K562) 와 Yeast extract를 Digestion 한후 각각 50 µg을 합쳐서 100 µg을 분획합니다. 

 

Experiment workflows

분획후 Elution은 바로 MS-spec Vial에 옮긴후 speedvac에서 건조시킵니다. 각 Vial당 20 uL (0.1% TFA)로 녹인후 5 µL 주입합니다.  전반적으로 모두 elution에서 펩타이드들이 잘 용리되는것 같습니다(크로마토그램 생략). 예상대로 5%에서는 펩타이드들이 나오지 않았고  또한 50% 이상에서도 거의 용리되지 않습니다. 5%에서 거의 용리되지 않고 그 이후 펩타이들이 용리된다면 좋은 현상입니다. 펩타이들이 컬럼에 잘 결합되어 있었다는 뜻입니다. 하지만 만약 일반 펩타이드 시료를 사용했을때 5%에서 많은 펩타이드를 보게 된다면 아마 실험조건을  바꿔야 합니다. 모든 분획은 25cm EasySpray column으로 90im Gradient를 사용하여 Oribrap Eclipse의 OT-IT mode를 사용하였습니다.

 

 

 

Single LC or Dual LC gradient

hpRP 분획은  high pH를 이용한 분획이긴 하지만 Acentotrile의 비율에 따라  펩타이드들이 용리 됩니다. 그러므로 펩타이들 용리 순서는 hydrophobicity 에 영향을 많이 받습니다. 이로 인해 분획순서대로 C18 에서의 크로마토그램은 점차 오른쪽으로 치우치게 됩니다.   분획별로 LC gradient를 바꿀 필요는 없지만 그래도 LC gradilent를 바꾸어주면 좀더 보기 좋은 크로마토그램을 볼수 있습니다. 아래는  25%의 분획에서 original LC gradient와 적절히 바꾸어진 LC gradient를 사용한  크로마토그램입니다.  특별히 데이타에는 큰 영향을 주지 않겠지만 그래도 보기는 좋습니다.  각각의 크로마토그램을 확인한후 22.5% 이후의 분획은 모두 변경된 LC gradient를 사용하였습니다.

 

 

Protein and Peptide #

아래는 검출된 단백질과 펩타이드 수 입니다. 22.5% 이후의 분획에서 변경된 LC gradient 를 사용했을때 조금더 많은 수의 단백질과 펩타이드가 검출되었습니다.  암튼 둘다 만개이상의 단백질이상 검출되었습니다.  실험과정에서 특별한 노력이 없이 분석했는데도 많은 단백질이 검출이 되었습니다. 물론 단일 종 (Human)으로만 분석하면 이 숫자는 나오지 않을수도 있습니다. Thanks Orbitrap Eclipse!!