Orbitrap Eclipse + FAIMS로 단백수/펩타이드 검출수 증가시키기

120min Gradient에서 약 6400 단백질 검출 

아직 최적화 되지 않은 상태이지만 FAIMS를 이용하여 1ug K562 단백질에서 120min gradient로 약 6400개의 단백질을 검출하였습니다. 분획을 하지않은 120min LC gradient 조건을 고려할때 꽤 많은 단백질이 검출되는것 같습니다. 특별히 기대를 하지 않았는데 예상외로 좋은 결과인것 같습니다.

 

아래는 FAIMS를 장착하고 몇가지 테스트를 진행한 내용입니다.

 

CV값에 따른 검출 단백질/펩타이드 종류

장비앞에 그냥 붙힌후 대표적인 2개의 CV값만 사용하면 될것 같지만  CV값에 따라 검출되는 펩타이드의 종류가 상당히 다르게 검출됩니다. 그렇기 때문에 시료의 종류나 시료의 양에 따라 최적의 CV값이 달라질수도 있을듯합니다. CV값에 따라 서로 다른 펩타이드가 검출됨으로 가능한 서로 다른 많은 CV값을 사용하면 좋을것 같지만 CV수가 많아질수록 역효과가 나는 부분도 있습니다. 보통 Gradient의 길에 따라 2개 혹은 3개를 사용합니다. 그리고 두가지의 CV 값을 사용할 경우 대략 20V 정도 차이나게 설정합니다. 아래는 Promega K562 extract 의 1ug digest를 이용하여 40, 50, 60, 70, 80V에서 얻어진 크로마토그램입니다

 

 

각 CV 값에서 서로 다른 패턴의 크로마토그램이 생성되었습니다. 아래는 각각에서 얻어진 단백질과 펩타이드를 이용하여 만든 벤다이어그램입니다.  펩타이드의 경우 CV값에 따라 상당히 다른 펩타이드가 검출된다는것을 알수 있습니다.  여러논문에도 나와있듯이 CV 값별로 상대적인 단백질 수와 펩타이드 수가 일치하는 않는 경우가 있습니다. 비록 적은 수의 펩타이드가 검출되었지만 단백질의 수는 더 많을 수 있습니다. 서로다른 단백질에 해당하는 unique한 펩타이드가 더 잘 검출되었다는 의미입니다. 그래서 최적화된 CV값을 정할때 실험목적에 따라  단백질수 혹은 펩타이드 수에 따라 적절히 결정해야 합니다. 

 

Protein # comparison

 

Peptide # Comparison

Dual CVs or Triple CVs ?

위의 벤다이어그램을 보면 CV별로 검출되는 펩타이드가 상당히 다릅니다. 그래서 최대한 서로 다른 CV값을 사용하면 더 많은 단백질을 찾을수 있지 않을까 생각이 듭니다. 하지만 CV값을 증가시킬수도 회생되는 부분이 있습니다.  FAIMS에서 각각의  CV값을 적용시키기 위해서는 각 CV마다 Experiment를 추가해야 됩니다. 한 CV값에서 MS1와MS2를 다 수행한후 다시 다음 CV에서 MS1와 MS2를 수행합니다. 그러므로 각 CV의 한 Cycle의 시간을 적절히 줄여야 됩니다.

 

보통 LC gradient time에 따라 CV 수를 정합니다. 60min일 경우 2개, 120min 이상일 경우 최적조건에서 3가지 CV값을 사용합니다. Exploris480를 이용한 테스트에서 3개의 CV를 사용하더라도 큰 효과를 못본것 같습니다. 하지만 Orbitrap Eclipse의 OTIT mode는 상당히 빠른 속도를 가지고 있기 때문에 그 효과가 좋지 않을까 생각합니다.

 

 

아래는 Dual CVs(-40 and -70) 과 Triple CVs(-40,-55,-70)을 이용하여 120 min LC gradient에서 얻어진 단백질/펩타이드 수입니다.  단백질 수에는 큰 차이가 나지 않지만 펩타이드 수에서는 Triple CVs 방법이 더 좋습니다.  아무튼 2시간 LC time에서 6천개 이상의 단백질이 검출된것이면 괜찮은것 같습니다.  

 

1ug K562 proteins with two different FAIMS CV sets

 

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