Orbitrap Eclipse+FAIMS으로 1ng HeLa standard 에서 단백질검출하기

Orbitrap Eclipse와 FAIMS(60min LC time)를 이용하여 1ng HeLa standard에서 약 1500개의 단백질을 검출하였습니다.

 

FAIMS를 잘 활용할수 있는 실험중 하나가 극미량의 시료를 분석하는것이 아닐까 생각합니다.  시료의 양이 적을수록 background 피크에 의해서 suppression 되는 영향이 상대적으로 큽니다.  보통   MS1 스펙트럼에서 펩타이드 피크들이 거의 보이지 않게 되거나 보이더라도 높이가 매우 낮습니다. 이로인해 background 피크들과 혼합되어 charge state가 구별이 안될경우가 있습니다.  Precursor ion의 피크가 높지 않으면 상대적으로 좋은 MS2 스펙트럼을 얻을수 없습니다. 또한 Charge state를 정확히 구별하지 못하면 database 검색시 펩타이드로 검출이 되지 않게 됩니다.

 

논문이나 Thermo 사의 Technical note등에서 1ng HeLa standard를  이용하여 분석한 결과들이 있습니다. 저도 일단 1ng HeLa standard를 이용하여 분석해보았습니다. 이 조건에서 최적화하여 차후 극미량시료를 분석할때 사용할 예정입니다. 사실 1ng정도의 수준의 시료를 분석할 일은 거의 없을듯합니다. 

 

1ng HeLa standard with FAIMS

1ng 는 상당히 적은 양이기 때문에 상대적으로 높은 값의 AGC 와 Maximum Injection time으로 설정을 하였습니다.

 

• Mass spectrometry : Orbitrap Eclipse (OT-IT mode)
• HPLC: Vanquish Neo
• Trap-column : Acclaim PepPap, 75µm x 20mm, 3µm, 100A
• Analytical Column: EasySpray 75µm x 25cm, 2µm C18
• Buffer A: 0.1% F.A. in H2O/ Buffer B: 80% ACN+20% F.A.
• Flow rate: 300nL/min
• Sample: 1ng HeLa standard
• LC time: 60min

 

 

 

이전 1µg K562 실험에서 2 개의 CV보다  3개의 CV값을 사용했을때 더 좋은 결과를 얻었습니다. 1ng HeLa standard에서도 2개와 3개의 CV값을 사용해보았습니다. 하지만 1ng 시료의 경우 3개의 CV 를 사용할 경우 오히려 역효과가 날것으로 예상됩니다.

 

1ngHeLa 시료를 분석시에는 Trap-column이 없이 direct injection mode에서 분석을 하는게 좋을것 같습니다. 하지만 일단 Trap-column mode로  먼저 테스트를 해보았습니다.  아래는 1ngHeLa에 대한 chromatogram입니다. 1ng의 양임에도 불구하고 FAIMS로 인해 높은 background peak들이 제거되어서 예상보다 아주 좋은 크로마토그램이 형성되었습니다.

 

 

Chromatogram of 1ngHeLa standard with FAIMS

아래는 Thermo사에서 분석한 결과입니다. 0.5ng HeLa standard에서 2000개의 단백질을 검출하였습니다.

상당히 많은 단백질이 검출이 되었습니다. 아마 trap-column이 없이 direct injection mode로 분석하지 않았을까 생각합니다. 

Reference: Ultra Sensitive LC-MS Workflow for Single Cell Proteomic Analysis (LCMS.cz)

 

아래는 대표적인 두개의 CV값의 조합과 3개의 CV값에서 직접 분석한 결과입니다. 두개의 CV값을 가지는 -50/-70V에서 가장 많이 검출이 되었습니다. 약 1460개의 단백질이 검출이 되었습니다. 예상보다 많은 단백질이 검출된것 같습니다. Thermo사에 분석한 결과에는 못미치지만 일반 실험실에서 완전히 최적화하지 않은 상태에서 분석한 결과를 감안하면 괜찮은것 같습니다. 다시한번 Orbitrap Eclipse와 FAIMS의 감도에 놀라게 됩니다.