Thermo사 TKO TMT11 대신 실험실에 TMT11 standard 만들기

Thermo 사에서 TMT11 분석을 위한 standard mixture를 판매하고 있습니다.  지난번 구매해서 분석을 해보았습니다.

Orbitrap Eclipse의 MS3 SPS Real-time search를 활용한 TMT 분석 (TKO TMT 11-plex standard)

 

가격은 20 µg에 340불정도입니다.

https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A40938

바로 분석할수 있도록 만들어져 있기 때문에 아주 유용한것 같습니다.  Labeling이나 기타 전처리 과정을 할필요가 없습니다.  20 µg이지만 (아마도)펩타이드 수준에서 정량이 된것이라 실험실에서 Digestion하여 얻은 20 µg보다는 더 많은 양입니다. 보통 한번 분석시 100 ng정도만 주입해도 됩니다. 즉 200번이 상은 분석할수 있습니다.

 

 

TMT 시료를 분석하기 위해서는 high-pH RP fractionation을 수행합니다. TMT11을 위한 분획법을 최적화하기 위해서는 상대적으로 많은 양이 필요합니다. 하지만 이 Kit를 사용하여서 최적화하기에는 적은양입니다. 분획을 위해서 한개의 kit를 다 사용하기는 아깝습니다. . 그래서 실험실에서 오랫동안 사용할수 있는 TMT11 standard를 만들었습니다. 처음에 재료비가 많이 들어가지만 오랫동안 사용할수있습니다.

 

TMT11 kit / Protein Amounts

일단 TMT-10 kit 과 단일 TMT11 을 주문합니다. 이전 글에도 있지만 TMT kit는 메뉴얼에 적혀있는 단백질양 (최대 100ug)보다 더 많은 양을 사용해도 됩니다.

 

10-Plex TMT 에 100 µg이상의 단백질 Labeling 하기 (400 µg까지 확인) (tistory.com)

10-Plex TMT 에 100 µg이상의 단백질 Labeling 하기 (400 µg까지 확인)

즉 시료가 많다면 동일한 양의 TMT 시약에 최대한 많은 시료를 사용하면 좋습니다.그래서 한개의 TMT-11 kit를 두번 나누어  Promega사의 Human extract 와 Yeast extract 을 각각 100 µg씩 Labeling 하였습니다.

 

Standard Spike-in Proteins

TKO TMT-11 standard 와 같이 차이나는 각각의 단백질에 표준단백질을 일정 비율로 첨가합니다.

• BSA (Bovine) : Thermo Fisher, 23209
• Enolase (Yeast) : Millipore Sigma, E6126-500UN
• Alcohol dehydrogenase (Yeast) : Millipore Sigma A8656-1VL 

Kit의 Knock-out과 다르게  표준단백질을 일정 비율로 만듭니다. 어쩌면 실험에 더 가까울듯합니다.  이때 중요한것은 시료에 첨가할 표준단백질의 양입니다. 너무 적게 넣으면 검출이 되지 않으며 너무 많이 넣으면 전체 단백질의 양이 차이가 날 뿐더라 실제 실험모델에 적합하지 않습니다.  1µg human digest에 적합한 양을 찾기 위해서 시료 1µg당 1ng~10ng정도의 표준 단백질을 첨가하여 대략의 피크의 높이를 비교하였습니다. 1 µg human digest 당 10ng 표준단백질이 어느정도 잘 검출이 되었습니다. 최종적으로 아래와 같이 시료 100 µg 당 아래와 서로 다른 양의 표준 단백질을 첨가합니다. 

 

아래는 표준단백질의 이론적인 비율 그래프입니다.

• 정확한 비율을 위해서 먼저 표준단백질과 시료를 각각 Digestion 한후 TMT labeling 전에 표준단백질을 일정량으로 혼합니다.

 

• Human K562 와 Yeast 시료를 tryptic digestion한후  11개의 Tube로  나누게 됩니다.  이때 주의할 점은 11개의 tube에 정확히 동일한 양으로 나누어야 됩니다.  11개 이기 때문에 1100ul의 buffer를 사용하여 100ul 옮기게 되면 마지막에는 100ul보다 적게 남게 됩니다. 이를 위해서 안전하게 약 1200ul 의 buffer를사용한후 100ul씩 옮깁니다. 나중에 조금남는 용매는 적은양 (예 5uL)으로 다시 나누어 넣습니다 (최대한 버리는 양을 줄일수 있습니다).  혹은 1.2mg을 digestion한 1.2mL의 용매로 녹인후 100uL씩 옮겨도 됩니다

 

 

 

 

• 각각의 Standard protein digest를 위의 Table 비율로 첨가한후 TMT labeling을 합니다.

 

 

 

• 1개 TMT-11 kit로 1.1 mg Human 과 Yeast protein standard를  만들었습니다. 상당히 많은 양임으로 다양한 실험에서 최적화하는데 사용할수 있습니다.
• 아래는 Alcohol Dehydrogenase 펩타이드중 하나의 Reporter ions입니다.  

 

• 검출후 Proteome Discoverer로 검색후 얻어진 3개의 표준 단백질에 대한 상대적인 정량값입니다. 이론적인 값과 유사한 비율로 검출이 되었습니다.

Thermo 사의 TKO11 standard 시료에 비해서 저렴할뿐만 아니라  더 많은 양의 단백질을 만들수 있엇습니다. 이것으로 앞으로 다양한 분석조건을 최적화하는데 사용할 예정입니다.