Peptide fractionation of non-TMT and TMT mixture using C18 spin-column

높은 감도의 질량분석기 덕분에  HPLC를 이용한 펩타이드 분획보다는 Stage-tip(Spin-column)을 이용해서 간단히 분획을 합니다.  그중에 High-pH Buffer를 이용한 분획이 가장 쉽고 유용한것 같습니다. 

하지만 stage-tip에 충진되는 C18의 종류, 사이즈나  Buffer에 따라 분획되는 패턴이 다르게 됩니다.   Stage-tip에 충진되어 있는 C18도  제조회사에 따라 particle size나 Carbon loading 양 다릅니다. Buffer의 종류에 따라 서로 elution strength가  다를 수 가 있습니다. 또한  TMT 가 결합된 펩타이드는 더 hydrophobic하기 때문에 일반 펩타이드과 다른 패턴을 가집니다.

 

그러므로 본인이 주로 사용하는 Stage-tip 와 buffer를 정해서 최적화 시켜놓는게 좋습니다.  시료의 양의 제한이 없는 경우 보통 100 ug을 사용하여 분획합니다. 사용하는 컬럼은 harvar dapparatus사의  micro spin-colum (74-4601)을 사용합니다.  메뉴얼에는 capacity 가 60 µg까지라고 적혀있으나 100 µg 이상도 가능합니다. 최근 가격이 거의 두배로 올라서  다 사용하기 전까지 다른 제품을 찾아볼 예정입니다.

 

 

Harvard apparatus Micro Spin-column (74-4601)

 

 

구체적인 조건은 아래와 같습니다.

• Spin-column: Harvard apparatus Micro Spin-column (74-4601)
• Buffer:  Triethylammonium bicarbonate (18597-100mL, Millipore Sigma), Acetonitrile, TFA
• Loading Buffer: 0.1% TFA
• Washing Buffer 1: 0.1% TFA
• Washing Buffer 2: H2O
• Elution buffer 

• Centrifuge speed: 300 x g, 1min
• Loading/Washing buffer volume: 200 µL
• Elution Buffer: 150 µL
• Sample loading amount: 100 µg
• Sample: K562+Yeast (100 ug) / TMT labeled K562+Yeast (100 ug)  ( Thermo사 TKO TMT11 대신 실험실에 TMT11 standard 만들기 (tistory.com)

High-pH buffer를 이용한 분획이지만 Sample loading 시 0.1% TFA를 사용합니다. 이 조건에서 펩타이드들이 컬럼에 더 결합하기 때문입니다. 첫번재 Washing도 0.1% TFA로 한후 두번째는 H2O를 사용하여 낮은 pH를  올려줍니다. 그 후 high-pH buffer로 용리시킵니다.

 

Fractionation of Non-TMT and TMT mixture 

아래는 non-TMT와 TMT labeling 된 시료를 이용하여 분획한 각각의 크로마토그램입니다.

 

Non-TMT 시료의 경우 7.5%에서 부터 펩타이드들이 조금씩 용리되기 시작하였고 30%에서 모두 다 용리되었습니다.

TMT의 경우 7.5%에서도 펩타이드 피크들은 거의 검출이 되지 않았고 70%에서 상당량의 펩타이드가 용리되었습니다. TMT의 hydrophobic 한 성질로 인해 전체적으로 용리가 늦게 되었습니다. 5%에서 피크들이 보이지만 모두 1+를 가지는 background  피크들입니다. 5%를 수행하지 않고 바로 7.5%부터 시작할수 있습니다. 하지만 5%에서 펩타이들이 검출되지 않는것을 확인해야 합니다. 이것으로 초기에 펩타이들이 컬럼에 잘 결합되었다는 확인할수 있습니다.

 

 

 

Gradient Modification

22.5% 이후는 상대적으로 크로마토그램이 오른쪽으로 치우쳐 있습니다. hydrophobic 펩타이드가 많이 존재하기 때문입니다. 22.5% 이후에는 gradient를 약간 조정해서 더 넓게 퍼지도록 하였습니다. LC gradient를 시작한후 1분후 바로 10% B로 증가시킨후 조금더 급격한 gradident를 사용합니다.

 

 

아래 크로마토그램에서 보듯이 펩타이드들이 더 넓게 분포되었습니다. 22.5% 이후에는 모두 이 조건을 사용하였습니다.

많지는 않지만 조금더 단백질과 펩타이드들을 검출할수 있습니다.