Orbitrap Eclipse로 Histone H3의 Middle-down 펩타이드 분석하기

 

 

Histone 은 그 특성상 일반적인 bottom-up 방법으로는 분석이 거의 불가능합니다.  Propionylation 과 같은 유도체화를 시킨후 분석하는 bottom-up 과 Glu-C와 같은 enzyme을 이용하여 middle-down 방법을 사용합니다.

 

Histone Propinolylation을 통한 bottom-up proteomic analysis (tistory.com)

 

Histone H3 variants를 Glu-C로 절단하면 50개 이상의 amino acid를 가지는 큰 펩타이드가 생성입니다.  이렇게 긴 펩타이드에서 다양한 Isobaric PTM을 검출하는것은 쉽지 않습니다. LC와 MS 부분에서 최적화가 필요합니다.

실제 Histone 시료의 경우 다양한 PTM이 존재하기 때문에 PTM이 없는 단일 단백질로 연습을 하면 좋습니다.

 

판매되는  histone 표준시료는 recombinant 임으로 PTM이 존재하지  않습니다. New England Biolabs 사의 시료를 구매하였습니다. 

Histones Products | NEB

 

 

H3.1와 H3.3의 protein Sequence입니다.

>sp|P68431|H31_HUMAN Histone H3.1 OS=Homo sapiens OX=9606 GN=H3C1 PE=1 SV=2 MARTKQTARKSTGGKAPRKQLATKAARKSAPATGGVKKPHRYRPGTVALREIRRYQKSTE LLIRKLPFQRLVREIAQDFKTDLRFQSSAVMALQEACEAYLVGLFEDTNLCAIHAKRVTI MPKDIQLARRIRGERA

 

>sp|P84243|H33_HUMAN Histone H3.3 OS=Homo sapiens OX=9606 GN=H3-3A PE=1 SV=2 MARTKQTARKSTGGKAPRKQLATKAARKSAPSTGGVKKPHRYRPGTVALREIRRYQKSTE LLIRKLPFQRLVREIAQDFKTDLRFQSAAIGALQEASEAYLVGLFEDTNLCAIHAKRVTI MPKDIQLARRIRGERA

 

 

거의 동일한 Sequence이며 Glu-C로 절단시 아래와 같이 펩타이드가 생성됩니다.  한개의 Amino acid 의 차이가 납니다.

H3.1 ARTKQTARKSTGGKAPRKQLATKAARKSAPATGGVKKPHRYRPGTVALRE

H3.3 ARTKQTARKSTGGKAPRKQLATKAARKS APSTGGVKKPHRYRPGTVALRE

 

Standard Histone 3.1과 H3.3 를 Glu-C로 digestion 합니다. Cysteine이 없기 때문에 reduction과 alkylation과정은 생략합니다.

 

H3.1 and H3.3 Base-peak Chromatograms

아래는 100ng에 해당하는 Chromatogram입니다. 두개의 크로마토그램은 동일합니다.

 

 

 

아래는 H3.1과 H3.3에 해당하는 Precursor ion 의 MS1 입니다. +8부터 +14까지 넓은 범위로 존재합니다.

 

 

HCD and ETD fragmentation

Orbitrap Eclipse의 default 값의 HCD와 ETD로 얻은 MS2 스펙트럼입니다.

 

 

Orbitrap Eclipse의 ETD MS2의 default 값입니다

Use Calibrated Charge-Dependent ETD Parameters를 unchecked 한후 아래의 값을 사용하였습니다.

 

 

이 값으로 아주 좋은 ETD MS2 스펙트럼을 얻었습니다.

 

ETD spectrum of Glu-C digested Human H3.1 N-terminal tail