Home-made K562+Yeast TMT11 을 Spin-column으로 분획하여 분석하기

이전글에  소개한 Human K562 와 Yeast TMT labeling 시료를 이용하여  Orbitrap Eclipse로 분석을 해보았습니다.

펩타이드 분획은 이전글에 적힌대로 Spin-column 을 이용하여 High-pH fractionation을 이용하였습니다.

 

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Orbitrap Eclipse의 MS3 SPS Real-time search를 활용한 TMT 분석 (TKO TMT 11-plex standard)

High-pH fractionation시90 min gradient를 사용하였습니다.  아래는 각 분획에서 얻어진 크로마토그램입니다.

 

펩타이드가 상대적으로 많이 용리되는 영역인 22.5~70% 분획은 다시 120min gradient로 한번더 분석하였습니다.  

• 얻어진 raw file들은 Proteome Discoverer 2.5로 분석하였습니다.  아래는 90 min로만 분석한것과 22.5% 이후는 120min로 분석한것 두 방법에서 얻어진 단백질과 펩타이드 수 그래프입니다.  MS3 Real-time search 방법을 사용하였지만  Realtime search시 실수로  Human Database만 사용하였습니다. 하지만 PD결과에서는 Yeast도 검출이 되었습니다. Realtime search시 Yeast를 추가하였으면 조금더 많은 수가 검출되었을것 같기도 합니다. 

 

• 아래 그래프에서 보는것과 같이 120min가 포함된 결과에서 추가적인 단백질과 펩타이드가 검출되었습니다. 당연한 결과인듯합니다. 모든 분획을 120min으로 하면 더 많은 수가 검출되겠지만 상대적으로 펩타이드가 많이 용리되는 부분만 120min을 사용할 예정입니다. 

 

 

 

 

TMT labeling이 된 펩타이드는 상대적으로 hydrophobicility가 증가되기 때문에 뒤 쪽 용리분획에서 많이 검출되는것 같습니다.