Direct injection mode 로 1ng HeLa로 2000개 단백질 검출하기

• 양이 매우 작은 시료의 경우 최대한 시료의 손실을 줄이는 것이 중요합니다. 앞의 글에서 적혀있듯이 trap-column을 사용하지 않고 Analytical column으로 바로 주입함으로써 Trap-column에서 발생하는 손실을 어느정도 줄일수 있습니다.

Vanquish Neo에서 Direct injection mode 로 검출수 높이기 (tistory.com)

Vanquish Neo에서 Direct injection mode 로 검출수 높이기

Vanquish Neo nano UPLC 01 (tistory.com)

Vanquish Neo nano UPLC 02 (tistory.com)

• Vanquish Neo의 큰 장점중 하나는 Trap-column 와 direct injection mode를 쉽게 변경할수 있다는 것입니다. FAIMS가 장착된 Orbitrap Eclipse 의 iontrap mode에서 direct injection 으로 극미량의 시료에서 좋은 결과를 얻을수 있습니다. 또한 Proteome Discoverer에서 한개이상의 검색엔진을 사용하여서 검출수를 증대시킬수 있습니다.

 

• 분석조건은 아래와 같습니다.

Sample: Pierce™ HeLa Protein Digest Standard  Pierce™ HeLa Protein Digest Standard (thermofisher.com)

LC: Vanquish Neo

Column: EasySpray (ES902) 75um x 25cm, 2um

Mass spectrometry: Orbitrap Eclipse with FAIMS

LC Gradient

 

  

 

 Mass spectrometry Paramters

 

 

 

 

 

 

 

아래는 1ngHeLa에 대한 크로마토그램입니다. FAIMS로 인해 1ng 시료에서도 상당히 높은 S/N를 얻었습니다.

 

• Proteome Discoverer에서 검색조건입니다. Sequest HT, MS Amanda 2.0, MSPepSearch를 동시 사용하였습니다.

 

 

• 아래는 1ngHeLa에서 검출된 단백질과 펩타이드 수입니다. -55V 와 -70 V를 사용하여 분석후 Proteome Discoverer에서 3가지의 검색엔진으로 2,000개 이상의 단백질을 검출하였습니다. -45와 -65V에서는 조금더 적은 수의 단백질이 검출이 되었지만 펩타이드의 수는 조금 더 많이 검출이 되었습니다. 만약 3가지의 다른 CV값을 사용한다면 더 많은 펩타이드를 검출할 수 있겠지만 1ng 시료에 대한 MS2 Parameters에서는 CV값을 더 늘이면 오히려 검출수는 줄어듭니다.