Spectra-library 없이 dirDIA를 이용한 Phosphopeptide 분석 테스트

• Phosphopeptide 분석은  아마 가장 인기있는 PTM 분석중 하나일것입니다.  논문에도 다양한 분석방법이 소개되어 있습니다.  검출수를 높이기 위해서는 최대한  많은 양을 사용해서 많은 분획을 수행하면 됩니다. 즉 시료의 양과 시간이 많은 경우 이 방법이 가장 좋을수 있습니다. 하지만 사람에 따라 이러한 방법을 선호하지 않을수도 있습니다.

 

• 많은 수의 Phosphopeptide를 검출하게 되면 Volcano plot등의 좋은 그래프를 그릴 수 있지만  실제로 다음단계를 위해 선택되는 펩타이드의 수는 제한적일때가 있습니다. 10,000개를 검출하거나 5,000를 검출하거나 최종 선정되는 펩타이드는 크게 다를지 않을때가 있습니다.\

 

• Phosphopeptide 분석방법중에서 각각의 시료에서 Phosphopeptide를 enrichment하여 Label-free 방식으로 정량분석을 할수 있고 TMT로 Labeling후  enrichment를 할 수 있습니다. 개인적으로는 TMT labeling을 선호합니다. 일단 labeling을 하고 나면 enrichment과정에서의 bias는 없어지게 됩니다.  하지만 TMT 분석에서의 발생하는 Ratio compression 믄제가 있습니다.  MS3+Real time Search를 사용해볼 예정이지만 Phosphopeptide의 경우 MS3까지 수행할 경우 충분한 감도가 나올지 의문이 듭니다. 최근에는 DIA로 분석후 spectra-library없이 Spectronaut의 dirDIA로 분석하는 결과가 많이 나오고 있습니다.
• 본격적인 Phosphopeptide 분석 실험을 하기전에 대략 Orbitrap Eclipse 와 FAIMS에서 어떤 결과가 나오는지 확인해 보았습니다.   Mouse liver의 500 µg protein digest을 TiO2 beads로 간단히 enrichment하였습니다. 추가적인 fractionation은 하지 않았습니다. 총 20 µL중 5 µL를 사용하여 DDA (5µL)와 DIA(5µL) 로 분석해보았습니다.

 

 

 

 

• DDA Analysis
• DDA의 경우 TiO2 enrichment를 하지 않았을 경우 118개만 검출이 되었지만 enrichment 후  약 8,000개 이상의 Phosphopetide가 검출이 되었습니다. 

 

 

• dirDIA Analysis (Spectronaut 16)
• DIA의 경우 Spectronaut 16 프로그램을 이용하여 Spectra-library를 사용하지 않은 dirDIA로 분석하였습니다.  아래와 같이 약 8,000개 이상이 검출이 되었습니다. DDA와 유사한 숫자입니다.  

 

 

한번의 실험으로 결론을 내릴수는 없지만 DDA와 DIA를 비교해 보면 유사한 숫자가 검출이 되었습니다.  놀라운것은 Spectra-library 없이 Phosphopeptide를 DIA 분석이 가능하다는것입니다. 논문에서 읽었지만 직접해보기는 처음입니다. 만약 여러개의 시료를 이용하여 정량분석시 DIA가 정량성이 훨씬 높을것으로 예상됩니다.  정확히는 알수 없지만 FAIMS가 Phosphopeptide의 검출수를 증가시키는데 기여를 많이 했으리라 생각합니다.  TiO2 enrichment 과정은 아주 간단하고 짧은 시간이 소요됩니다. 보통 1시간 이내에 가능합니다. Fractionation없이 한번의 분석으로 Phosphopeptide를 약 8,000개 검출할수 있다면 괜찮은것 같습니다. 차후 최적화를 하면 더 많은 수를 검출할수 있으리라 생각합니다. 하지만 검출수보다는 정량성이 더 중요하기 때문에 검출 수는 적더라도 재현성 있는 정량값이 나올수 있도록 해야 될듯합니다.