EasyPep™ MS Sample Prep Kits로 1E3~1E6 Cells Analysis

현재 여기서 일하는곳의 좋은 점은 분석에 대한 범위를 우리가 정할수 있다는것입니다.  그렇지 않으면 다양한 분석에 대해 일일히 분석조건을 맞추어야 합니다. 

 

Cell lysates 의 경우 Thermo Fisher사의 Thermo Scientific™ EasyPep™ MS Sample Prep Kits 를 사용합니다. 그리고  안전한 시료의 양이 1E6 cells 이상만을 요청합니다.   실제로 2ug정도 밖에 주입을 하지 않지만 충분한 수의 세포를 사용하게 되면 모든 과정이 순조롭습니다. 적화된 전처리 방법을  루틴하게 사용할수 있도록 고정된 시료의 양을 요청하는것이 저희 입장에서는 좋습니다.

 

 

하지만 부득이 시료의 양이 적을때를 위해서 몇가지를 테스트 해보았습니다.  서로 다른 HEK293 cell 수 (1E6, 1E5, 1E4 and 1E3) 를 전처리하여 DIA로 분석했습니다. 

 

시료의 양에 따라 EasyPep Kit의 Reagents의 양을 조절해야 되나  이번 테스트에서는  순순히 시료 수에 따른 변수를 확인하기 위해서 모든 과정은 동일하게 하였습니다.

 

•   Kit에 포함된 Lysis  Buffer로 단백질을 추출후 BCA로 측정한 총 단백질 양입니다. BCA 분석시 상당한 양의 시료가 소비되기 때문에 1E3 시료의 경우 시료의 손실이 꽤 있습니다.

 

• 아래는 1E3~1E6의 시료를 각각 2 µg주입한 후 얻은 크로마토그램입니다. 1E6에서 1E4까지는 큰 차이가 없지만 1E3에서 상당한 차이를 보입니다.

 

 

• Spectronaut18로 분석한후의 단백질과 펩타이드 수입니다. Digestion후 2 µg을 각각 LC-MS/MS에 주입하되 1E3는 2번 나머지는 3번씩 주입하였습니다. 아래는 크로마토그램입니다.

 

  Γ  1E6와 1E4사이에는 검출수의 차이가 거의 없습니다. 하지만 1E3에서 검출수가 확연히 줄어들었습니다.

아마 Kit의 capacity가 허용되지 않는 양인듯합니다. 정확한 이유는 모르겠지만 Kit안에 포함된 cleanup cartridge에서도 시료의 손실이 많은듯합니다. 극미량의 시료의 경우 시료의 손실이 더 큰것은 당연합니다. ┘